葉綠體色素提取、分離、定量及理化性質(zhì)鑒定

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1、實驗日期：2011.9.28葉綠體色素的提取、分離、定量及理化性質(zhì)的鑒定一、實驗原理葉綠體色素是植物吸收太陽光能進行光合作用的重要物質(zhì)，主要由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復合體。1.葉綠體色素的結(jié)構(gòu)與分離葉綠素a為藍黑色固體，在乙醇溶液中呈藍綠色；葉綠素b為暗綠色，其乙醇溶液呈黃綠色。Chla與Chlb是吡咯衍生物與鎂的絡合物，它們很相似，不同之處僅在于Chla第二個吡咯環(huán)上的一個甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。?Chla與Chlb?是

2、植物進行光合作用必需的催化劑，易溶于石油醚等非極性溶劑中。通常植物中葉綠素a的含量是葉綠素b的三倍。其結(jié)構(gòu)式如下：類胡蘿卜素是一種橙色的天然色素，屬于四萜，為一長鏈共軛多烯，有α、β、γ三種異構(gòu)體，其中β異構(gòu)體含量最多。β-胡蘿卜素(R=H)和葉黃素(R=OH)葉黃素是一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體內(nèi)，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在石油醚中溶解度較小。秋天，高等植物的葉綠素被破壞后，葉黃素的顏色就顯示出來。葉綠素與類胡蘿卜素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。提

3、取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當用適當?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動相）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后，可將各種色素分開。1.葉綠體色素的物理性質(zhì)葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當它從第一單線態(tài)返回基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。因為分子吸收的光能有一部分消耗于分子內(nèi)部的振動上，發(fā)射的熒光的波長總是比被吸收光的波

4、長要長。2.葉綠體色素的化學性質(zhì)葉綠素的化學性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。在酸性條件下，卟啉環(huán)中央的鎂離子可以被H+取代，產(chǎn)生褐色的去鎂葉綠素。葉綠素中的Mg2+也可以被其它金屬離子，如Cu2+或Zn2+等取代，此時葉綠素仍保持綠色。葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。根據(jù)朗伯-比爾（Lambert-Beer

5、）定律，某有色溶液的吸光度A值與其中溶質(zhì)濃度C以及光徑L成正比，即A＝aCL（a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)）。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光值可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下的吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素提取液中葉綠素a、b含量，只需測定該提取液在2個特定波長下的吸光度度值，并根據(jù)葉綠素a與b在該波長下的吸光系數(shù)即可求出各自的濃度。在測定葉綠素a、b含量時，為了排除類胡蘿卜素的干

6、擾，所用單色光的波長應選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80％丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關系式：(1)A663=82.04Ca+9.27Cb(2)A645=16.75Ca+45.6Cb式中A663、A664分別為波長663nm和645nm處測定葉綠素溶液的吸光度值；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃

7、度(g/L)。解聯(lián)立方程(1)、(2)可得以下方程：(3)Ca=0.0127A663-0.00269A645(4)Cb=0.0229A645-0.00468A663如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，(3)、(4)式則可改寫為：(5)Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645(6)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663葉綠素總量(7)CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663葉綠素總量也可根據(jù)下式求導A652=34.5×CT由于652nm為葉綠素a與b

8、在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(等吸收點)，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），因此也可以在此波長下測定一次吸光度（A652）求出葉綠素總量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5(8)因此，可利用(5)、(6)式可分別計算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(8)式可計算葉綠素總量。一、實驗目的1、掌握提取和分離葉綠體色素的方法；2、掌握測定葉綠體色素含量的方法；3、熟悉葉綠體色素的理化性質(zhì)及吸光特性；4、了解植