基因沉默與rnai技術(shù)

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1、基因沉默與RNAi技術(shù)定義：基因沉默雙是指鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。RNA干擾是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由雙鏈引發(fā)的植物RNA沉默，主要有轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常轉(zhuǎn)錄;PTGS是啟動了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)

2、基因會同時導(dǎo)致TGS和PTGS?；虺聊且环NRNA干擾技術(shù)。RNA干擾是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結(jié)合，將其剪切成21-25nt及3'端突出的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，隨后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在靶mRNA上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分

3、解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制.一、基因沉默的分類及其機制（一）轉(zhuǎn)錄水平基因沉默轉(zhuǎn)錄水平基因沉默是指對基因?qū)Ｒ坏募?xì)胞核ＲＮＡ合成的失活，它的發(fā)生主要是由于基因無法被順利轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的ＲＮＡ而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機制主要有以下幾種：１．基因及其啟動子甲基化甲基化是活體細(xì)胞中最常見的一種ＤＮＡ共價修飾形式，通常發(fā)生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的堿基上，該區(qū)堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制，該區(qū)甲基化的頻率在人類及高等植物中分別可達(dá)４％

4、和３６％。［４］近來的研究表明，發(fā)生在轉(zhuǎn)基因啟動子５'端的甲基化是造成轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的主要原因。雖然轉(zhuǎn)基因的甲基化可延伸至轉(zhuǎn)基因的３'端，但甲基化過程均是從啟動子區(qū)域開始的。從所報道的轉(zhuǎn)基因沉默例子來看，幾乎所有的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象與轉(zhuǎn)基因及其啟動子的甲基化有關(guān)。２．同源基因間的反式失活反式失活主要是由于擁有同源序列的沉默位點和其他位點的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通過順式作用而甲基化并失活的基因能作為一種"沉默子"，對其他與之分離的具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并

5、導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。３．后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默后成修飾作用是指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。４．重復(fù)序列外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上，形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對頭、尾對尾的反向重復(fù)，則不能表達(dá)，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因

6、沉默與在真菌中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列誘導(dǎo)的點突變相類似，均可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種配對結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達(dá)。５．位置效應(yīng)位置效應(yīng)是指基因在基因組中的位置對其表達(dá)的影響。當(dāng)外源基因整合到高度甲基化、轉(zhuǎn)錄活性低的異染色質(zhì)區(qū)域時，外源基因一般表現(xiàn)沉默，這說明毗鄰ＤＮＡ的甲基化和異染色質(zhì)化對插入的外源基因影響很大，可能導(dǎo)致外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上失活。如果轉(zhuǎn)基因插入轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū)域或異染色質(zhì)區(qū)域，轉(zhuǎn)基因通常會融人該區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)基因進(jìn)行很低水平的轉(zhuǎn)錄，或使轉(zhuǎn)基因發(fā)生異染色質(zhì)化而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基

7、因沉默。（二）轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默是指基因在細(xì)胞核內(nèi)能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)穩(wěn)定態(tài)ｍＲＮＡ存在的現(xiàn)象。與轉(zhuǎn)錄水平基因沉默不同，轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默具有逆轉(zhuǎn)性，即受抑制基因通過減數(shù)分裂可以恢復(fù)表達(dá)活性，表現(xiàn)為減數(shù)分裂不可遺傳性。目前發(fā)現(xiàn)主要有以下幾種轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默現(xiàn)象。１．共抑制共抑制是最常見的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。這一現(xiàn)象首先由Ｎａｐｏｌｉ在轉(zhuǎn)ＣＨＳ基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)。共抑制現(xiàn)象普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。共抑制的發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基

8、因的表達(dá)同時受到抑制。具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無ｍＲＮＡ積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。若導(dǎo)入的外源基因與內(nèi)源基因無序列同源性，外源基因自身也常常會發(fā)生轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動子的強度等因素有關(guān)。２．基因壓制Ｃｏｇｏｎｉ等在粗糙脈抱霉的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的