人類外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)與核型分析小論文

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1、實驗名稱：人類外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)與核型分析姓名：指導教師：專業(yè)：生物科學實驗班級：實驗時間：實驗地點：遺傳實驗室成績：人類外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)與核型分析一.實驗目的1.掌握人體微量血液體外培養(yǎng)、制備染色體標本的方法。2.掌握離心機使用、低滲處理、染色、采血技術(shù)。3.學習對人的外周血淋巴細胞進行核型分析。一.實驗原理人體外周血液中小淋巴細胞，通常都在G1期或GO期，一般情況下是不分裂的。當在離體培養(yǎng)條件下，加入植物凝血素(PHA),小淋巴細胞受刺激轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，隨后進入有絲分裂。經(jīng)過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和同定，就可獲得大量的有絲分裂

2、細胞。人體外周血的形成包括紅細胞、白細胞、血小板，其中紅細胞和血小板不能離體培養(yǎng)，白細胞中含有小淋巴細胞。所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當?shù)呐嗯囵B(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細胞。外周血淋巴細胞是不能增殖的分化細胞群，在體外無菌培養(yǎng)條件下，若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G1期或GO期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，重新有絲分裂的能力，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，即可獲得大量分裂期細胞以供染色體分析。秋水仙素可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細胞分裂順利進入后期而停滯丁

3、?中期，從而可在短期內(nèi)積累大量最適于進行染色體分中期分裂相。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形而利于辨認。體外培養(yǎng)的原理是將離體的細胞放入培養(yǎng)基中進行生長繁殖，保持細胞的生命活力，便以對細胞進行各方面的研究。體外培養(yǎng)技術(shù)己經(jīng)廣泛應用在雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，微生物制藥技術(shù)，基因轉(zhuǎn)染與細胞融合以及細胞轉(zhuǎn)化工程技術(shù)等方面。低滲處理的目的是使水分通過細胞膜向細胞內(nèi)滲入，導致轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，染色體進一步分散而利于分析。同時，低滲處理還可使紅細胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清屮被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細胞，改善

4、了淋巴細胞的固定質(zhì)量及標本質(zhì)量。一.實驗材料、試劑和儀器1.實驗材料：人外周血淋巴細胞2.實驗用具：2毫升滅菌注射器，離心管，吸管，試管架，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶，酒精燈，燒杯，載玻片，切片盒，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，顯微鏡。3.試劑藥品：(1)RPMT“1640”培養(yǎng)基：稱取“1640”粉末10.5克，用1000ml的雙蒸水溶解，如溶液出現(xiàn)混濁或難以溶解時，可用干冰或C0/氣體處理，如pH值降至6.0時，則可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO,1.0—1.2g,以干冰或C02氣體校正pH至7.0—7.2。立即以5號或6號細菌漏斗過濾火菌，分裝待

5、用。(2)肝素：作為抗凝劑使用。稱取該粉末160mg(每mg含126U),用40ml的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為每ml500U。高壓消毒8磅15rdn。(3)秋水仙素：作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細胞質(zhì)的粘度；抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停留在中期。稱取秋水仙素4mg,用100ml生理鹽水溶解，用6號細菌漏斗過濾，然后放入冰箱4'C保存。使用吋用lml注射器吸取該溶液0。05—0.lml加入5ml的培養(yǎng)物中，其最終濃度為0.4—0.8ug/ml。(4)植物凝血素(PHA):是淋巴細胞有絲分裂刺激劑。提取PHA的方法冇兩種。一種比較簡單，直接用

6、四季豆的浸出液；另一種較復雜，最后制品為粉末。如用之得當，二種方法均可獲得良好的效果。鹽水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它顏色如紅斑色、黑色.黃色，白色的四季豆亦可。取豆子20g,用水洗凈可能粘附在種子外面的化學藥物。先在水中浸過夜(4°C)，次日倒去水分，將豆子放入組織攪碎器內(nèi)，加30ml生理鹽水，開動攪碎器使之成為粘糊狀，向攪碎器再加70ml生理鹽水，混合均勻。置冰箱24h。然后以3000轉(zhuǎn)/min離心15min，取上清液，用生理鹽水稀釋10倍，5號除菌濾斗過濾，分裝小瓶，冰凍保存。酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理鹽水洗凈。將豆浸入60ml鹽水

7、屮，保存于4°C冰箱內(nèi)，24h后用組織攪碎器將其磨成勻漿，再加140ml鹽水，置4°C冰箱中24h，取出后以6000轉(zhuǎn)/min離心20min,吸取上清液，調(diào)pH至5.6（用0.lmol/LHCl調(diào)）之后，每100ml上清液加40ml無水酒精,加以攪拌，以3000轉(zhuǎn)/min離心15min,取上清液，棄去沉淀。在每100ml上清液中加170mll0%乙醚無水酒精（10ml乙醚十90ml無水酒精）以3000轉(zhuǎn)/min離心15min，取沉淀放入培養(yǎng)皿屮，在含有硅膠的抽氣干燥器屮抽氣2—4d，沉淀物逐漸變得干硬。將沉淀物研磨成粉末，以0.85%NaCl液配成1%的

8、溶液，此PIIA溶液經(jīng)細菌濾器過濾后分裝在小瓶中，冰凍保存。使用吋每5ml培養(yǎng)物