功能基因的序列比對(duì)方法

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1、功能基因的序列比對(duì)<1>.切除載體和(或)引物a.打開(kāi)所有的原始引物序列于一個(gè)EditSeq的窗口中b.exportallasonec.保存d.打開(kāi)這個(gè)保存的文件，開(kāi)始切除載體和引物e.選擇載體插入點(diǎn)兩側(cè)的序列(10-15個(gè)的樣子)搜索注意：不存在正反向的問(wèn)題，都是一個(gè)方向，因?yàn)闇y(cè)序的時(shí)候是選擇兩個(gè)載體上的引物其中的一條來(lái)往后測(cè)序的！切完之后另存為f.重新打開(kāi)這個(gè)文件，開(kāi)始切除引物方法同切載體，但是要注意正反向的問(wèn)題。比如mcrA基因，其引物為Forward:5'-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACA

2、GC-3'Reverse:5'-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3'先找Forward5’端，此時(shí)只找到的部分序列。切去5’端。然后再切這些切掉5’端序列的3’端的序列，此時(shí)其3’端序列應(yīng)該是Reverse的反向互補(bǔ)序列。切去這個(gè)反向互補(bǔ)序列，這樣一來(lái)這個(gè)些序列就已經(jīng)被切去兩端的引物了。但此時(shí)還剩下另一部分未切除任何引物的序列，此時(shí)記下這些序列的編號(hào)，先切去Reverse5’端。再用Forward的反向互補(bǔ)序列切去3’端，這樣剩下的序列也都被切除兩端的引物了。<2>將所有序列調(diào)整為同向序列：a.選擇前面記錄編

3、號(hào)的序列，將這些序列一個(gè)個(gè)都轉(zhuǎn)換為其反向互補(bǔ)序列。這樣一來(lái)所有的序列都成為同向序列了，即在DNA兩條反向互補(bǔ)鏈的其中一條上的比較了。b.保存該文件<3>生成OTUsGoogle搜索”FastgroupII”或http://fastgroup.sdsu.edu/fg_tools.htm(Onlinegrouping--注意勾選的選項(xiàng))Choosemethod里面相似度可以選97%或98%提交之后出現(xiàn)的窗口如可以看到被分為了10個(gè)OUT每個(gè)OUT都自動(dòng)選擇了一個(gè)代表序列。全選將其復(fù)制到word中，備用。并把其中的那些代表序列都復(fù)

4、制下來(lái)粘貼到TXT保存。<4>尋找嵌合體:一般是對(duì)16SrRNA來(lái)說(shuō)的兩個(gè)網(wǎng)站：http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html(或搜decipherchimera)http://comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl(或搜bellerophonchimeracheck)<5>翻譯網(wǎng)站：http://pfam.sanger.ac.uk/在保存有OTUs的TXT文件中，一個(gè)一個(gè)翻譯成蛋白質(zhì)序列。最后保存。在用Expa

5、sy翻譯的時(shí)候選擇第二個(gè)選項(xiàng)點(diǎn)擊翻譯理想的情況是這段序列中應(yīng)該是沒(méi)有終止序列的即”-”符號(hào)，因此先選擇閱讀框較長(zhǎng)，整段序列也沒(méi)有終止子的那些，如圖，先選擇第二個(gè)。復(fù)制紅色的區(qū)域，在blast上比對(duì)，看是否是需要的序列，如果是。那么就選擇此結(jié)果，如果不是，再一一比對(duì)其他的羅列結(jié)果。或者直接將DNA序列提交到sanger上，出現(xiàn)如下結(jié)果Frame2中有一段綠色，顯示就是mcrA的保守家族。那么Frame2即為正確的翻譯方法。另存為，只保留pro的序列的TXT改名為.FAST格式<6>尋找最相似序列打開(kāi)這個(gè)FAST文件，開(kāi)始一個(gè)個(gè)

6、找最相似序列了。在這個(gè)窗口，開(kāi)始blast。找到一個(gè)序列后復(fù)制其DNA的編號(hào)點(diǎn)擊這個(gè)按鈕出現(xiàn)這個(gè)窗口把復(fù)制的DNA編號(hào)手動(dòng)輸入點(diǎn)擊OK則這個(gè)序列被自動(dòng)添加到了FAST文件里了。一般一個(gè)序列尋找3個(gè)相似度不等的序列。最后，保存為一個(gè)新的FAST文件。<7>畫(huà)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)打開(kāi)前面的FAST文件，全選文件”W”一下，再直接點(diǎn)OK左右兩頭各刪除帶*之前的序列，另存為新的FAST文件。打開(kāi)這個(gè)FAST文件開(kāi)始畫(huà)樹(shù)。<8>最后對(duì)畫(huà)的樹(shù)進(jìn)行一些修飾。