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1、法醫(yī)DNA檢材Chelex-->第1章緒論法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)的主要對(duì)象是生物物證，即人的細(xì)胞核基因組DNA。法醫(yī)DNA檢材一般分為常量檢材、微量檢材、接觸檢材等。常見的常規(guī)檢材包括人血、唾液和混合斑等。本文中涉及的常量檢材主要指血痕和唾液斑。標(biāo)準(zhǔn)的血斑載體包括FTA卡、濾紙、紗布（線）、棉簽，部分唾液斑是送檢煙蒂。這些常見的載體中，紗布（線）長(zhǎng)時(shí)間保存DNA的效果較棉簽差；棉簽不利于DNA分子的釋放；濾紙長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)使溶液中漂浮紙纖維；煙蒂過(guò)濾嘴部位的煙紙通常是含色素的；標(biāo)準(zhǔn)FTA卡含有特殊成分，能更大限度防止DNA降解，但純水浸泡清洗時(shí)不容易去除血色素。因此，對(duì)不同的檢
2、材載體，需要分別研究其最佳提取量；另外，常量檢材在提取、保存、送檢的過(guò)程中可能會(huì)存在不同程度的DNA降解、含有各種雜質(zhì)等現(xiàn)象，所以提取過(guò)程中的體系體積、加入的Chelex-100及蛋白酶K的量、消化時(shí)間、變性時(shí)間，甚至浸泡清洗過(guò)程都可能會(huì)對(duì)提取的DNA模板質(zhì)量產(chǎn)生影響。Chelex-100提取法的不足之處是原始檢材的所有成分，包括蛋白、肝素、血紅素以及檢材基質(zhì)中所含的染料等各種雜物都在提取后的DNA液中，有時(shí)可能會(huì)對(duì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)生影響[8]。長(zhǎng)時(shí)的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血紅素；但同時(shí)清洗檢材時(shí)可能損失部分DNA，所以應(yīng)平衡清洗抑制劑與損失DNA之間的關(guān)系。但是，由于
3、Chelex-100法有DNA提取時(shí)間短、提取方法簡(jiǎn)便、成本不高，提取過(guò)程不換管，減少了可能造成檢材污染的環(huán)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，在Chelex-100法的基礎(chǔ)上還可以對(duì)DNA提取進(jìn)行各種純化，目前，Chelex-100法已經(jīng)成為法醫(yī)DNA提取的基本方法。.........第2章實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1材料、儀器和試劑為最大限度降低其他條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，每個(gè)對(duì)照組所用的檢材及試劑均采用同一的，不同對(duì)照組（即編號(hào)前兩位字母一致的檢材）盡量在同一條件、同一時(shí)間、同一臺(tái)機(jī)器上進(jìn)行提取、定量、擴(kuò)增、電泳。降解檢材及腐敗檢材因DNA含量不定且含有大量DNA擴(kuò)增干擾物，為提高檢驗(yàn)一次成功率一般
4、采用磁珠法，不在本實(shí)驗(yàn)討論范圍內(nèi)。Chelex-100濃度：分別剪取0.2cm×1.0cmFTA血卡溶于100μL5%chelex-100、10%chelex-100、15%chelex-100、20%chelex-100，編為BB組。蛋白酶K：在0.2cm×1.0cmFTA血卡+100μLchelex-100體系中，分別加入3μL、5μL、8μL、10μL、20μL蛋白酶K（PK），編為BC組。56℃消化時(shí)間：對(duì)0.2cm×1.0cmFTA血卡+100μLchelex-100+10μLPK體系，分別56℃消化30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘，編為BD組。98
5、℃變性時(shí)間：對(duì)0.2cm×1.0cmFTA血卡+100μLchelex-100+10μLPK體系，分別98℃變性3分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、20分鐘，編為BE組。2.2方法剪取適量生物檢材，置于0.5ml離心管內(nèi)，加入適量純水，震蕩30秒，室溫浸泡20分鐘[33]，13,000rpm離心5分鐘，吸棄上清，管底留約20μl左右液體及檢材基質(zhì)，加入30—150μlChelex-100及PK5-20μl，56℃30至90分鐘不等，100℃5-20分鐘，10,000rpm離心2分鐘，上清備用[34]。取適量唾液斑樣品，放入0.5ml的離心管中，加入0.5ml純水，振蕩混勻30秒
6、，室溫浸泡30分鐘；13,000rpm離心3分鐘，去除上清液，保留載體；加入100μl10%Chelex-100溶液和5μlPK，56℃保溫1小時(shí)，振蕩5-10秒；98℃變性15分鐘，振蕩30秒；13,000rpm離心2分鐘，4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增效果可能受環(huán)境溫度、擴(kuò)增試劑盒存放時(shí)間、擴(kuò)增液混勻程度等因素影響，因此，根據(jù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委（AS）關(guān)于DNA實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的相關(guān)要求，每次擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)該同時(shí)擴(kuò)增controlDNA（9947）以作陽(yáng)性對(duì)照，觀察擴(kuò)增效果；以擴(kuò)增純水作為陰性對(duì)照，觀察有無(wú)體系污染。第2章實(shí)驗(yàn)材料與方法.....................152.1材料、儀
7、器和試劑.....................152.2方法.....................22第3章結(jié)果與討論.....................273.1Qubit2.0定量結(jié)果.....................273.2電泳結(jié)果.....................44第4章結(jié)論.....................64第3章結(jié)果與討論3.1Qubit2.0定量結(jié)果檢材量對(duì)照組：將常量生物檢材按載體材質(zhì)分為組，每小組取5個(gè)樣本盡量保持相同條件進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察平均
