卵胞漿內(nèi)單精子注射后人精子激活鼠卵母細(xì)胞能力的研究

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1、卵胞漿內(nèi)單精子注射后人精子激活鼠卵母細(xì)胞能力的研究-->[摘要]目的:研究各種質(zhì)量精子的鼠卵母細(xì)胞激活能力。方法:選用20~25g昆明種雌性白鼠,超排卵取卵細(xì)胞,用Percoll密度梯度離心法處理正常精液、少精、弱精、畸精以及冷凍后的正常精液,選擇優(yōu)質(zhì)的精子進(jìn)行顯微注射,計(jì)算卵母細(xì)胞激活率、卵細(xì)胞形態(tài)正常率。結(jié)果:各種質(zhì)量精液中優(yōu)選的精子激活鼠卵母細(xì)胞能力差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論:人精子激活鼠卵母細(xì)胞能力與最初精液狀態(tài)沒(méi)有直接的相關(guān)性,它不受精子數(shù)量、活力、運(yùn)動(dòng)性及形態(tài)的影響。卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmicinjec-tion,ICSI)技術(shù)是目前世界范圍內(nèi)廣

2、泛開(kāi)展的治療男性不育癥的顯微受精技術(shù)。據(jù)報(bào)道,ICSI后卵細(xì)胞平均受精率為65%~70%,尚有大約1/3的卵子未能受精[1]。研究表明,精子激活卵細(xì)胞相關(guān)因子(sperm-bornoocyte-activatingfactor,SOAF)對(duì)卵細(xì)胞的激活作用在ICSI技術(shù)中起著關(guān)鍵的作用[2]。本文依據(jù)人精子激活鼠卵母細(xì)胞理論,在本室建立的人精子注入小鼠卵母細(xì)胞模型基礎(chǔ)上[3],對(duì)各種質(zhì)量精子激活鼠卵母細(xì)胞能力進(jìn)行研究,為ICSI前對(duì)精子能否激活卵母細(xì)胞進(jìn)行篩選技術(shù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本校動(dòng)物中心提供的飼養(yǎng)于人工晝夜周期的昆明種雌性白鼠,體重20~25g,喂以含微量元素標(biāo)準(zhǔn)

3、飼料,自由攝水,分籠飼養(yǎng)。1.2試劑小牛血清、孕馬血清(PMSG)、人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、M199粉由北京百靈克生物科技有限責(zé)任公司提供,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、10Earle′s溶液、透明質(zhì)酸酶(BoviypeV)、Percoll、Milli-Q水由Sigma公司提供。1.3儀器倒置相差顯微鏡(MM188),解剖鏡和倒置鏡(日本Nikon),恒溫孵箱TC2323、恒溫平臺(tái)(美國(guó)Shel.LAB),顯微注射儀、EG-400微型磨針儀、PN-30顯拉針儀、MF-900微型鍛針儀(日本NARISHGECo.Led.Group)。1.4樣品采集和處理雌性小鼠超排卵及采卵法見(jiàn)

4、參文[4]。取出卵細(xì)胞后置孵箱中培養(yǎng)2h,用100IU•ml-1透明質(zhì)酸酶的HBE液處理1min,培養(yǎng)液沖洗2次,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。人精優(yōu)選和處理:精液標(biāo)本于本研究室不孕癥門診,患者禁欲3~5d,手淫法無(wú)菌取精,液化后,按u;m,針尖斜面為30°,針尖彎度25~35°。固定針內(nèi)徑為15~20μm,外徑60μm,針尖斜面30°,針尖彎度25~35°。顯微操作準(zhǔn)備及操作過(guò)程見(jiàn)參文[5]。1.6實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組按es;106個(gè)•ml-1,a級(jí)精子>25%或者前向運(yùn)動(dòng)精子>50%(a級(jí)和b級(jí)),形態(tài)異常率2結(jié)果2.1操作過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞激

5、活能力的影響①實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組卵母細(xì)胞激活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)組(P0.05),其中正常組較其他4組略高,畸型精癥組卵細(xì)胞激活率最低,結(jié)果見(jiàn)表2。卵細(xì)胞第二極體的排出在注射后2h左右,提示卵細(xì)胞已經(jīng)被激活。本研究結(jié)果中大部分激活卵細(xì)胞沒(méi)有原核形成,可能卵細(xì)胞被激活排出極體后,發(fā)育停滯。3討論精子能否激活卵細(xì)胞是ICSI技術(shù)成功的關(guān)鍵。研究表明,SOAF是啟動(dòng)卵母細(xì)胞激活的關(guān)鍵因素。SOAF包含一個(gè)或更多精子頭膜下的熱敏感蛋白質(zhì)成分和至少一個(gè)熱穩(wěn)定的核周基質(zhì)中成分,它們共同作用激活卵細(xì)胞,無(wú)種屬特異性[2]。資料顯示SOAF的不表達(dá)能引起ICSI的失敗。目前臨床上還沒(méi)有一種直接檢測(cè)SOAF方法

6、,也沒(méi)有建立一種檢測(cè)精子激活卵細(xì)胞能力的實(shí)驗(yàn)。有人曾用金黃地鼠卵和蛙卵進(jìn)行研究,但易受操作程序的影響,人卵又不易獲得。本研究室依據(jù)人精子激活鼠卵母細(xì)胞理論[3]已建立了檢測(cè)人精子激活能力的模型[4]。本研究就是在此模型基礎(chǔ)上將各種質(zhì)量精液的精子注入鼠卵母細(xì)胞中,觀察卵細(xì)胞的激活情況,以檢測(cè)人精子激活卵母細(xì)胞的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,少精、弱精、畸形精癥以及冷凍精組精子優(yōu)選后的卵母細(xì)胞激活率與正常組比較均有不同程度的降低,但差異無(wú)顯著性,說(shuō)明可能在最初的精液檢查中精子的密度、形態(tài)及活力對(duì)卵母細(xì)胞激活率影響不是很大。Percoll較其他方法能夠回收更多的形態(tài)正常的精子,并明顯增加精子的活力和體外生

7、存能力。本研究應(yīng)用Percoll法對(duì)各種質(zhì)量的精液進(jìn)行處理,選擇優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行ICSI注射,這可能也是各組之間差異無(wú)顯著性的原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,少精、弱精、畸形精癥以及冷凍精組激活率與正常精液組比較差異無(wú)顯著性,但有降低趨勢(shì),提示精子激活卵母細(xì)胞的能力也受到影響,這是否表明精子中存在SOAF缺乏,還有待進(jìn)一步研究。精子生成基因位于Y染色體長(zhǎng)臂,由多個(gè)基因位點(diǎn)組成。AZF缺乏或突變能導(dǎo)致精子數(shù)目減少或缺乏[6]。