青環(huán)海蛇中有效物質(zhì)1

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1、青環(huán)海蛇中有效物質(zhì)1：羅海燕，雷羽，熊亮，王霞摘要】目的建立HPLC法測定青環(huán)海蛇中有效物質(zhì)1-甲基海因的含量。方法DikmainertsilSIL-100A(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動相為正己烷-乙醇(82∶18，V/V)，檢測波長為218nm，流速為1.0ml·min-1，柱溫為25℃。結(jié)果1-甲基海因質(zhì)量在0.448～1.568μg之間線性良好，r=0.9995;平均加樣回收率為99.34%，RSD為2.12%。結(jié)論該測定方法簡便快捷、準確性好、精密度高，可用于青環(huán)海蛇中有效物質(zhì)1-甲基海因的

2、含量測定，為海蛇質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜;青環(huán)海蛇;1-甲基海因海蛇為眼鏡蛇科海蛇亞科的一類毒蛇，目前世界上發(fā)現(xiàn)的海蛇約有90種。其藥用始載于唐代陳藏器的《本草拾遺》，“主赤白毒痢，五野雞病，惡瘡。炙食，亦燒末服一、二錢匕”。作為祛風燥濕、通絡(luò)活血、攻毒和滋補強壯等功效良藥，常被用于治療風濕痹痛、四肢麻木、關(guān)節(jié)酸痛、疥癬惡瘡等癥[1]。東南亞海域游移的海蛇有9屬15種，主要集中于中國南海海域，青環(huán)海蛇為該海域優(yōu)勢蛇種。目前對海蛇的化學成分含量測定的報道較少，前期我們在藥效實驗的指導(dǎo)下，從青環(huán)海蛇

3、中分離得到1-甲基海因?，F(xiàn)代研究表明1-甲基海因含有活性酰脲基團，具有廣泛的生理活性[2]。本文采用高效液相色譜法測定了3批青環(huán)海蛇中1-甲基海因的含量，以期為海蛇的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)?！　?材料與儀器　　1.1藥品1-甲基海因(自制，純度大于90%，采用面積歸一化法測定);甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純)，正己烷、乙醇、醋酸乙酯(分析純，經(jīng)過重蒸處理)。3個批次青環(huán)海蛇藥材?！　?.2儀器島津LC-10ATVP高效液相色譜儀(SPD-10A紫外檢測器，N2010數(shù)據(jù)工作站);BP211S型(Max220g，d=0.

4、1mg)Sartorius電子分析天平;BUG25-12型超聲波發(fā)生器(上海)?！　?方法與結(jié)果　　2.1色譜條件色譜柱為DikmainertsilSIL-100A(4.6mm×250mm，5μm);流動相為正己烷-乙醇(82∶18);流速為1.0ml·min-1;檢測波長為218nm;柱溫為25℃。供對照用1-甲基海因、樣品色譜圖見圖1～2?！　D11-甲基海因色譜圖　　圖2青環(huán)海蛇供試品色譜圖　　2.2檢測波長的選擇通過UV掃描，1-甲基海因在218.32nm波長處有最大吸收，故選擇218nm為測定波長。結(jié)果見圖

5、3?！　D31-甲基海因掃描圖　　2.31-甲基海因溶液的制備取1-甲基海因10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成0.112mg·ml-1的溶液，即得?！　?.4供試品溶液的制備取青環(huán)海蛇粗粉1g，精密稱定，置100ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇40ml，回流提取90min，濾過并濃縮至10ml，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得?！　?.5線性關(guān)系的考察分別精密吸取1-甲基海因溶液4，6，8，10，12，14μl注入高效液相色譜儀，測定各自峰面積?！　?.7精密度實驗精密吸取樣品供試液10

6、μl，在上述色譜條件下重復(fù)進樣5次，測定峰面積，計算相對標準偏差RSD=1.28%，儀器精密度符合要求。結(jié)果見表3和圖6。表2供試品溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果表3精密度實驗結(jié)果　　2.8重復(fù)性實驗按擬定的含量測定方法，取同一批藥材粗粉制備5份供試品溶液，分別進行測定，測得峰面積值并計算1-甲基海因的含量。結(jié)果平均含量為1.090mg·g-1，RSD=1.94%，表明重復(fù)性良好。結(jié)果見表4。表4樣品重復(fù)性實驗　　2.9加樣回收率實驗精密稱取青環(huán)海蛇藥材粗粉各9份，分別加入1-甲基海因溶液適量，按“2.4”項下供試品溶液制備方法

7、，制備加樣回收供試品溶液，并測定每份的含量，計算回收率。結(jié)果見表5表5加樣回收率實驗　　2.10樣品含量測定分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μl，進樣，記錄峰面積，按外標法計算青環(huán)海蛇中1-甲基海因的含量。結(jié)果見表6。表6青環(huán)海蛇藥材中1-甲基海因的含量測定結(jié)果　　3討論　　目前對海因類藥物含量測定的研究較缺乏。主要有非水滴定法和分光光度法，而這兩種方法的誤差相對較大，不夠準確[3]。選用DIKMAC18(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以甲醇-水、乙腈-水、異丙醇-水、乙腈-水-磷酸等為流動相，均不

8、能達到分離要求，且多種比例條件下，相對保留時間太短(tR﹤3min)，藥材中1-甲基海因不能與其他成分分離。選用DIKMAinertsilSIL-100A(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以醋酸乙酯-甲醇、異丙醇-乙醇、正己烷-乙醇等為流動相進行條件探索，其中正己烷-乙醇(82∶18)，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長218