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《凋亡蛋白抑制因子livin基因sirna表達(dá)載體》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、凋亡蛋白抑制因子livin基因siRNA表達(dá)載體【摘要】目的：構(gòu)建3個(gè)針對(duì)凋亡蛋白抑制因子livin基因mRNA的小干擾RNA(siRNA)表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染HCT-8/V細(xì)胞。為研究livin基因沉默對(duì)HCT-8/V細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿特性的影響奠定基礎(chǔ)。方法：合成3對(duì)靶基因livin的siRNA寡核苷酸序列通過(guò)退火生成轉(zhuǎn)錄模板，與線性pGCsi-H1/Neo/GFP質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α鈣化菌抽提重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-8/V細(xì)胞并用G418篩選。結(jié)果：轉(zhuǎn)化大腸桿菌涂布平板長(zhǎng)出陽(yáng)性菌落，測(cè)序結(jié)
2、果與所設(shè)計(jì)、合成的livin的siRNA轉(zhuǎn)錄模板序列一致；在熒光顯微鏡下觀察到HCT-8/V細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)證實(shí)重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并用G418剔除了未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞。結(jié)論：成功構(gòu)建livin基因的siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染并篩選出轉(zhuǎn)染了livinsiRNA表達(dá)載體的HCT-8/V細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】小干擾核糖核酸質(zhì)粒凋亡蛋白抑制因子轉(zhuǎn)染[Abstract]Objective:Toconstruct3eukaryoticexpressionvectorsofshorthairpinRNA(shRNA)againstl
3、ivingeneandthentransfectintoHCT-8/Vcells,andtopavetheRNAsequencesplates,andthenlinkedidpGCsi-H1/Neo/GFPtogeneratesiRNAeukaryoticexpressionvectors.Plasmidsed.Theninsertsequencesplatesequencesaccordingtosequencing.ExpressionofgreenfluorescentproteinintransfectedHCT-8
4、/Vicroscopy.Conclusions:Therebinantvectorsallinterferingribonudeoacid;Plasmid;Inhibitorofapoptosisprotein;Transfection凋亡蛋白抑制因子livin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，livin的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤耐藥[1]有關(guān)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種高效的基因表達(dá)阻斷技術(shù),它通過(guò)體外合成或體內(nèi)表達(dá)在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生與目的基因同源的含21~23個(gè)核苷酸的雙鏈小分子干擾RNA片
5、段(smallinterferingRNAs,siRNA)。siRNA制備方法有多種，若在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)持久表達(dá)siRNA以期長(zhǎng)久抑制靶基因，通常采用表達(dá)載體的方法。本研究擬構(gòu)建3個(gè)livin基因siRNA表達(dá)載體,用此載體轉(zhuǎn)染耐長(zhǎng)春新堿的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8/V,為研究RNAi技術(shù)抑制livin在耐長(zhǎng)春新堿結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8/V中的表達(dá)，進(jìn)一步探索livin的siRNA對(duì)逆轉(zhuǎn)HCT-8/V細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的效果從而為研究腫瘤耐藥的基因治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)準(zhǔn)備。1材料與方法1.1材料pGCsi-H1/Neo/GFP表達(dá)
6、載體與siRNA模板退火緩沖液（上海吉?jiǎng)P公司），T4DNA連接酶、內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ（Promega公司）。PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海華舜公司）。高純質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技公司）。HCT-8/V耐長(zhǎng)春新堿細(xì)胞株、胰酶、G418（南京凱基生物公司）。RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（上海吉泰公司）。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2000（Invitrogen公司），3對(duì)livinsiRNA轉(zhuǎn)錄模板序列由上海生工生物工程公司合成。1.2方法1.2.1siRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計(jì)與合成Livin基因
7、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪接方式不同有兩種mRNA亞型Livinα和Livinβ，兩者在第六外顯子差54個(gè)堿基，因此以兩者序列共同部分為模板，根據(jù)GenBank報(bào)道的livinmRNA序列(Livinα為BC014475，Livinβ為AF311388)用Ambion公司的siRNA在線軟件設(shè)計(jì)，并根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則[2]挑選3條發(fā)卡結(jié)構(gòu)的siRNA序列模板，分別命名為siRNA-liv158，siRNA-liv625，siRNA-liv1234。經(jīng)BLAST檢索確認(rèn)與livin以外的人類已知基因序列無(wú)同源性。3個(gè)靶序列和相應(yīng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)
8、模板如下:（1）siRNA-liv158 靶序列為5’-AAAGACAGTGCCAAGTGCCTG-3′，其發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板為：（2）siRNA-liv625靶序列為5’-AAGAGACTTTGTCCACAGTGT-3’，其發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板為：（3）siRNA-liv1234靶序列為5’-AACT
