酵母rna的提取及組份鑒定與核酸的定量測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)酵母RNA的提取及組份鑒定與核酸的定量測(cè)定【課前預(yù)習(xí)】1.為什么用稀堿溶液可以使酵母細(xì)胞裂解？2．如何從酵母中提取到較純的RNA?3．干擾RNA的提取的物質(zhì)有哪些并設(shè)計(jì)排除這些干擾的實(shí)驗(yàn)。4．干擾紫外線（UV）吸收法測(cè)定核酸濃度實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)有哪些？【目的要求】1.了解并掌握稀堿法提取RNA的原理和方法。2.了解核酸的組分并掌握其鑒定方法。3.學(xué)習(xí)紫外線（UV）吸收法測(cè)定核酸濃度的原理?！净驹怼坑捎赗NA的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也很各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)是最常用的。組

2、織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3-4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5

3、利用等電點(diǎn)沉淀。酵母含RNA達(dá)2.67-10.0%，而DNA含量?jī)H為0.03-0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解，從水解液中可用定糖，定磷和加銀沉淀等方法測(cè)出上述組份的存在。核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用來(lái)表示。為每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。測(cè)得未知濃度核酸溶液的A260nm值，即可以計(jì)算出其中RNA或DNA的含量。該法

4、操作簡(jiǎn)便，迅速，并對(duì)被測(cè)樣品無(wú)損，用量也少。核酸摩爾消光系數(shù)及相應(yīng)光吸收值ε(P)含磷量/(%)A260nmpH7，260nm1μg/mLRNA7700-78009.50.022-0.024DNA-Na鹽66009.20.02（小牛胸腺）蛋白質(zhì)也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處，在260nm出的吸收值僅為核酸的1/10或更低，因此對(duì)于含有微量蛋白質(zhì)的核酸樣品，測(cè)定誤差較小。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nmx吸收的比值則在1.9左右，當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)

5、含量較高時(shí)，比值下降。若樣品內(nèi)混在有大量的蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光的物質(zhì)，應(yīng)設(shè)法先除去?！緦?shí)驗(yàn)用品】1.試劑1)0.04MNaOH溶液；2)95%乙醇；1.5M硫酸；3)濃氨水；4)0.1M硝酸銀；5)酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl；6)三氯化鐵濃鹽溶液：將2mL10％三氯化鐵（FeCl3·6H2O）溶液加入400mL濃HCl；7)苔黑酚(3,5-二羥基甲苯)乙醇溶液：稱取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。8)定磷試劑：（1）17％硫酸：將17mL濃硫酸（比重1084）緩緩傾入83mL水中；（2）2

6、.5％鉬酸銨：2.5g鉬酸銨溶于100mL水中；（3）10％抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL水，棕色并保存溶液；臨用時(shí)將三種溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸銨：10％抗壞血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。9)鉬酸銨－過(guò)氯酸沉淀劑：取3.6mL70%過(guò)氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中，即成0.25%鉬酸銨－2.5%過(guò)氯酸溶液。10)5-6%氨水：用25-30%氨水稀釋5倍。11)鉬酸銨－過(guò)氯酸沉淀劑：取3.6mL70%過(guò)氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中，即成0.2

7、5%鉬酸銨－2.5%過(guò)氯酸溶液。12)5-6%氨水：用25-30%氨水稀釋5倍。1.測(cè)試樣品干酵母粉。2.器材移液管0.2mL（×1），0.5mL（×2），1mL（×4），2mL（×4）；滴管；容量瓶50mL（×3）；量筒10mL（×1）；離心機(jī)；分光光度計(jì)；冰??；水浴鍋。【方法步驟】1.酵母RNA提取稱5g干酵母粉懸浮于30mL0.04MNaOH溶液中并在研缽中研磨均勻。懸浮液轉(zhuǎn)入三角燒瓶，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管。3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后，將上清慢慢傾入10mL酸性乙醇，邊加邊攪動(dòng)。加畢，靜置

8、，待RNA沉淀完全后，3000r/min離心3min。棄去上清液。用95％乙醇洗滌沉淀兩次。再用乙醚洗滌沉淀一次后，用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量，計(jì)算。2.RNA組份鑒定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL,沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。1)嘌呤堿：取水解液1mL加入過(guò)量濃氨