地塞米松對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)和stat6表達(dá)的

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1、地塞米松對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)和STAT6表達(dá)的【摘要】目的：研究地塞米松對支氣管哮喘小鼠急性氣道炎癥反應(yīng)的作用及對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子6(STAT6)表達(dá)的影響。方法：用免疫組織化學(xué)法檢測給予地塞米松后哮喘小鼠肺組織中STAT6的表達(dá)。結(jié)果：哮喘組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EOS)絕對值顯著高于對照組(P<0.01),上述炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)地塞米松組比哮喘組明顯減少(P<0.01)。HE染色示地塞米松組小鼠氣道炎癥反應(yīng)程度較哮喘組減輕。STAT6在氣道上皮細(xì)胞表達(dá),哮喘組氣道上皮細(xì)胞中STAT6表達(dá)較對照組增加,地塞

2、米松組STAT6表達(dá)與哮喘組比較明顯減少,較對照組增加。支氣管上皮細(xì)胞STAT6蛋白與BALF中的EOS絕對值呈顯著正相關(guān)。結(jié)論：地塞米松可在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng),作用機(jī)制可能是通過下調(diào)肺臟組織中STAT6蛋白的過度表達(dá),從而抑制依賴于STAT6/IL4通路的急性氣道炎癥反應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】支氣管哮喘;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子6;Th1/Th2;地塞米松;小鼠糖皮質(zhì)激素在治療哮喘方面的一線作用已勿庸置疑,其可以抑制多種炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的生成及釋放,降低血管通透性,提高β2受體的敏感性,對于哮喘的急性炎癥及慢性氣道重塑都有肯定的療

3、效[12]。本研究通過觀察地塞米松對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的影響及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子6(STAT6)在氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)情況,探討地塞米松治療哮喘的分子機(jī)制,為臨床治療提供理論依據(jù)?！　?材料與方法1.1材料　　1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組24只清潔級BALB/c小鼠,雄性,6周齡,體重18～20g,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號為SCXK(蘇20070001)。采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為哮喘組、地塞米松組和對照組3組,每組8只。哮喘組、地塞米松組分別于第0、7天腹腔注射0.2ml致敏液[含卵白蛋白(OVA)100μg加氫氧化鋁400μg的

4、生理鹽水溶液],14d后將小鼠置入自制密閉箱(30cm×45cm×54cm)內(nèi),用10g·L-1OVA溶液超聲霧化激發(fā)哮喘,30min·d-1,連續(xù)7d。地塞米松組每次激發(fā)前半小時(shí)予地塞米松2mg·kg-1腹腔注射;對照組全部以生理鹽水代替。　　1.1.2標(biāo)本采集3組小鼠在OVA最后1次激發(fā)后24h眼球摘除采血,頸椎脫臼處死小鼠,打開胸腔,結(jié)扎左肺門根部,取出左肺投入10%中性福爾馬林溶液中固定。頸前暴露氣管,做橫形切口插入靜脈留置針,進(jìn)行右側(cè)支氣管肺泡灌洗。　　1.1.3主要儀器和試劑勃林格殷格翰超聲霧化器、臺(tái)式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠,自制密

5、閉箱、OVA(GradeⅡ)、氫氧化鋁凝膠購自美國Sigma公司。地塞米松磷酸鈉注射液購自浙江仙居制藥股份有限公司,兔抗小鼠STAT6多克隆抗體購自美國CellSignaling公司。　　1.2方法　　1.2.1肺泡灌洗液(BALF)的留取在環(huán)狀軟骨上用血管鉗固定氣管,其下作橫行切口,置入連接注射器的硅膠管,分3次緩慢注入生理鹽水,每次注入量為0.3ml,每次灌洗后立即回收置于離心管中,計(jì)量,回收率約80%以上,于-4℃儲(chǔ)存,2h內(nèi)作細(xì)胞分離?！　?.2.2BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)采用離心機(jī)對BALF液以1500r·min-1離心

6、10min,細(xì)胞沉淀用0.5mlPBS液重懸,取0.1ml于血細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)測定細(xì)胞總數(shù),sa染色進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù),EOS絕對值計(jì)數(shù)使用伊紅染液染色。　　1.2.3HE染色取左肺以中性福爾馬林固定,石蠟包埋后切片,行HE染色。每只各做5張切片,觀察支氣管及周圍的炎癥細(xì)胞浸潤情況。　　1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測肺組織STAT6蛋白表達(dá)肺組織STAT6表達(dá)檢測步驟按SP使用說明書進(jìn)行。一抗:STAT6兔抗小鼠多克隆抗體,稀釋度為1∶400;二抗及檢測試劑盒為SP工作液,3,3二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,蘇木精復(fù)染,陽性細(xì)胞核著色呈棕黃色。本實(shí)驗(yàn)STAT6

7、蛋白陽性表達(dá)主要集中于各級支氣管(細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管和呼吸性細(xì)支氣管)的上皮細(xì)胞。顯微鏡下觀察組織著色情況,細(xì)胞質(zhì)清晰、染色呈棕色為陽性,采用圖像分析軟件(ImageProplus4.5)對STAT6陽性部位進(jìn)行原位定量檢測,每張切片隨機(jī)選用5個(gè)視野(10×40),自動(dòng)選取陽性部位并計(jì)算相對IOD值?！　?.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對樣本先行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),條件滿足時(shí),用單因素方差分析(Onel-1　　組別n細(xì)胞總數(shù)EOS計(jì)數(shù)對照組87.96±0.620.08±0.061)地塞米松組89.02±2.501)0.29

8、±0.091)哮喘組818.18±2.172)，3)1.73±1.012)，3)1)與哮喘組比較，P<