實(shí)驗(yàn)六氨基酸的紙層析法

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1、氨基酸的紙層析法一．目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機(jī)溶劑組成。展層時(shí)，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強(qiáng)；有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，它與濾紙纖維親和力弱。有機(jī)溶劑在濾紙上又下向上移動(dòng)的，稱為上行法；有上向下移動(dòng)的，稱為下行法。將樣品在濾紙上確定的原點(diǎn)處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進(jìn)行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來(lái)，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、

2、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動(dòng)速率（Rf值）Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時(shí)，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動(dòng)速率相同或相近，就不能將它們分開(kāi)，為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點(diǎn)為原點(diǎn)，在用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試?yàn)主要介紹的是單向?qū)游龇āＦ渲谢旌习被嵊芯彼?、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實(shí)驗(yàn)儀器1、?新華濾紙2、?層析缸3、?細(xì)線4、?點(diǎn)樣管5、?橡皮筋6、?電吹風(fēng)7、?噴霧器四、實(shí)驗(yàn)試劑1、?

3、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮—無(wú)水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無(wú)水丙酮，貯于棕色瓶中五、實(shí)驗(yàn)步驟1、取濾紙剪成20×10厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細(xì)線，在另一端2~3cm處用鉛筆畫(huà)一橫線，中間畫(huà)一圓點(diǎn)（原點(diǎn)）。2、取毛細(xì)管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原點(diǎn)處點(diǎn)樣，樣點(diǎn)直徑不宜超過(guò)5mm,每點(diǎn)一次用吹風(fēng)機(jī)吹干，點(diǎn)2~3次為佳。3、點(diǎn)樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點(diǎn)樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，

4、當(dāng)展層至另一端1~2cm處時(shí)，停止展層（大約2~3小時(shí)）。4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風(fēng)吹干（或烘箱60℃）烘干。5、均勻噴上茚三酮—無(wú)水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。6、用吹風(fēng)機(jī)吹干，觀察層析點(diǎn)，確定其幾何中心。7、量取數(shù)值，計(jì)算各自的Rf值，與表中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。（書(shū)上圖譜橫著看）六．實(shí)驗(yàn)結(jié)果從左到右依次為H、H1、H2、H3、H4。H1=1.0cmH2=4.4cmH3=5.0cmH4=0.99cmH=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735

5、Rf4=0.08461據(jù)此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）組成。七．實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。拖尾現(xiàn)象是指展層，顯色后在層析分配圖上，所看到的某一種氨基酸的分子位移，不是如標(biāo)準(zhǔn)圖譜所示的那樣，完整地顯示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那樣，前端粗圓而逐漸細(xì)小下來(lái)，宛如拖著一個(gè)尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現(xiàn)，是在實(shí)驗(yàn)中對(duì)影響Rf值的主要因素要求，掌握不夠所致。諸如，物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性對(duì)Rf值的影響，層析溶劑對(duì)Rf值的影響，PH對(duì)Rf值的影響(溶劑、濾紙和樣品的PH值)，溫度對(duì)Rf值的影響，濾紙的質(zhì)地

6、是否均勻，薄厚是否適當(dāng)，纖維的松緊度是否適中等對(duì)Rf值的影響，展層的方式(上行、下行)對(duì)Rf值的影響。然而在多次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)論怎佯嚴(yán)格遵循其影響Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。此時(shí)，這就需要從具體操作規(guī)范方面，諸如樣品的處理，點(diǎn)樣、展層、顯色等幾個(gè)操作程序去考慮思索，經(jīng)仔細(xì)分析，樣品的處理是為除去雜質(zhì)純化樣品，達(dá)到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像；展層過(guò)程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進(jìn)行，使樣品達(dá)到一個(gè)適當(dāng)?shù)奈灰?，便于在顯色后從圖象上，區(qū)分不同樣品的氨基酸；顯色是在用配制好的，與水不相混合，并揮發(fā)性較快噴霧后

7、迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低，不會(huì)影響洋品的斑點(diǎn)擴(kuò)散，那么問(wèn)題就集中在點(diǎn)樣這個(gè)操作程序上了。點(diǎn)樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液，和為了對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而分別配制的幾種氨基酸的溶液，用微量點(diǎn)樣管或毛細(xì)管，或血球計(jì)數(shù)器將5一j5微升的樣品，點(diǎn)在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設(shè)計(jì)好的多點(diǎn)位置中去。點(diǎn)樣后要自然風(fēng)干，或冷風(fēng)吹干。最好不要用加熱裝置，如吹風(fēng)機(jī)，燈泡之類的熱源將其樣品點(diǎn)加速干燥。因?yàn)榧訜嵫b置在學(xué)生操作時(shí)，一但注意不夠，掌握不好，則溫度升高勢(shì)必要使樣品破壞，更會(huì)使佯品點(diǎn)干的太燥。正是由于這樣，樣品點(diǎn)太干燥，使其樣品物的分子，

8、牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過(guò)程中，樣品點(diǎn)的每個(gè)物質(zhì)分子，不能在層析紙上同時(shí)起步，而是形成了有先有后，魚(yú)貫而上行或下行的狀況，最終使洋品物質(zhì)的分子，不能同時(shí)都集中到達(dá)一個(gè)位置。致使在顯色后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖象上，觀