成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法

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1、成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法【摘要】目的:探討三種分離成年大鼠心肌細(xì)胞的方法。方法:分別應(yīng)用酶消化法（0.1%的胰蛋白酶和0.1%膠原酶依次消化）、程序冷凍后機(jī)械分離法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃凍存）、酒精和多聚甲醛固定后機(jī)械分離法分離心肌組織獲取單個(gè)心肌細(xì)胞懸液。光鏡觀察,結(jié)合形態(tài)學(xué)和臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞。結(jié)果:用三種方法新分離的活性心肌細(xì)胞比率約70%～80%、桿狀、橫紋清晰。結(jié)論:三種方法均可以對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行良好的分離。【關(guān)鍵詞】大鼠;心肌細(xì)胞;細(xì)胞分離【ABSTRACT】Objective:Tostudythem

2、ethodsofisolatingadultratventricularcardiomyocytes.Methods:Themethodofenzymedigestion(0.1%trypsinand0.1%collagenasebyturns)ormechanicalmethod:mechanicalisolationafterprocedurecryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freezeandkeepunder-196℃)ormechanicalisolationafteralcoholandparaform

3、fixationusculartissuesandobtainsinglecardiomyocytesuspension.Thecardiomyocytesorphologicallyobservedicroscopeandevaluatedthroughtrypanbluedying.Results:Viabilityoffreshlyisolatedadultratventricularcardiomyocytes,yocytescanbeisolatedethods.【KEYEM(GIBCO)干粉,由雙蒸去離子水配置液體]正壓過(guò)濾除菌,pH7.2～7.4,-20

4、℃保存。1.1.3主要器材光學(xué)顯微鏡(Olympus),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),FA21045N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)1.1.4心肌細(xì)胞分離大鼠用25%烏拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取適量待測(cè)心肌組織（下列操作均除水浴和離心外均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行）立即放入預(yù)冷的DHanks液中,沖洗3次。將心室肌用眼科剪剪成1mm3大小組織塊,然后加入0.1%胰蛋白酶溶液10ml,37℃水浴8min后,吸取上層混懸液移棄。再加入0.1%膠原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力攪拌器攪拌30～40min后,吸取上層混懸液，放在預(yù)冷10%DMEM中終

5、止反應(yīng)。剩余沉淀物再加0.1%膠原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力攪拌器攪拌30～40min后,吸取全部液體，終止反應(yīng)?；鞈乙河?00目孔徑不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾除去未消化組織,在室溫下800～1000轉(zhuǎn)/min離心3～5min，棄上清，沉淀加入培養(yǎng)液2ml,混勻。1.2程序冷凍后機(jī)械法1.2.1動(dòng)物同上。1.2.2試劑DMEM(GIBCO)，F(xiàn)icoll(Pharmacia)，KrebsHenselEit緩沖液（mM）（NaCl118,KCl4.8,MgSO41.2，KH2PO41.2,NaHCO325,Glucose11，pH7.4），蒸餾水溶解后，經(jīng)0.22μm濾膜抽

6、濾消毒，備用。0.1MPBS（mM）（NaCl138,KCl2.7,KH2PO41.2,Na2PO48.1，pH7.4）,蒸餾水溶解后，高壓蒸汽消毒，備用。1.2.3主要儀器FA21045N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),B600型離心機(jī)（白洋離心機(jī)廠(chǎng)），光學(xué)顯微鏡（Olympus）等。1.2.4心肌細(xì)胞的分離大鼠麻醉后，開(kāi)胸迅速取心臟，將待測(cè)部分左心室放在60%甘油的DMEM的凍存管中，程序冷凍，最后保存于液氮中備用（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃凍存）。從液氮中取出保存的心臟，迅速放入40℃水浴中解凍。用DMEM清洗心臟

7、，將左心室剪碎成1mm3的小塊，于KH液中吹打10min以分離心肌細(xì)胞，必要時(shí)可重復(fù)一次。將含心肌細(xì)胞的溶液用100目網(wǎng)篩過(guò)濾，800轉(zhuǎn)/min離心5min，0.1MPBS清洗兩次，800轉(zhuǎn)/min離心。將沉淀輕輕加入4%的Ficoll上，400轉(zhuǎn)/min離心4min，棄上清，沉淀即為高純度的桿狀心肌細(xì)胞。1.3酒精和多聚甲醛固定后機(jī)械法1.3.1動(dòng)物同上。1.3.2主要儀器100目、300目篩子，眼科剪刀，眼科鑷子，平皿，離心機(jī)等。1.3.3單細(xì)胞懸液的制備將待測(cè)心肌組織用生理鹽水沖洗后置于70%酒精和4%多聚甲醛溶液(0.1MpH7.4)固定，4