吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞增殖與凋亡的影響

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1、吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響【摘要】目的研究吉西他濱體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的作用。方法應(yīng)用MTT法，流式細(xì)胞儀，AnnexinVPI雙標(biāo)法，Tunel法等多項(xiàng)方法，體外研究吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用；采用免疫組化的方法，觀察藥物作用后bcl2表達(dá)的變化。結(jié)果吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，并有促凋亡效應(yīng)，對(duì)細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)為S期的阻滯，藥物處理的細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)伴有bcl2的下調(diào)。結(jié)論吉西他濱可抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡是吉西他濱抗腫瘤作用機(jī)制的原因之一，而且凋亡與bcl

2、2的表達(dá)有一定關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】吉西他濱細(xì)胞凋亡非小細(xì)胞肺癌bcl2　　0引言　　非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后比較差，盡管現(xiàn)在的治療不斷發(fā)展，生存率提高的還是很少[1]。凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的主要原因,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡已成為當(dāng)前腫瘤治療的熱點(diǎn)。吉西他濱（gemcitabine,2′,2′difluoro2′deoxycytidine,dFdC）是一種新型的脫氧胞苷類(lèi)似物和核苷還原酶抑制劑，對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤活性[2]。但是體外研究其對(duì)非小細(xì)胞肺癌的凋亡作用及其凋亡機(jī)制的研究尚且不多?！　?材料和方法　　1.1藥物與試劑　　吉西他濱（健擇,生產(chǎn)廠(chǎng)家：LILLYFRANCE

3、S.A,注冊(cè)證號(hào)：H20020180），RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清為Gibico公司產(chǎn)品，bcl2單克隆抗體購(gòu)于北京晶美公司，HEPES，四氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），碘化丙啶（PI），免疫組化試劑盒，AnnexinVPI雙標(biāo)凋亡試劑盒均為北京中山生物公司產(chǎn)品?！　?.2細(xì)胞培養(yǎng)　　人肺腺癌細(xì)胞A549由同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5%CO2,37℃，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1∶1)消化傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期?！　?.3細(xì)胞體外生長(zhǎng)活

4、性的檢測(cè)（MTT法）　　取指數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液做空白對(duì)照。貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱,按常規(guī)方法操作后，用酶聯(lián)免疫儀測(cè)490nm處的吸光度（A490）值?！　?.4流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期　　各組藥物處理細(xì)胞72h后，進(jìn)行細(xì)胞消化，收集所有懸浮細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105～1×106個(gè)/ml,取1ml細(xì)胞，1000r/min離心5min，去培養(yǎng)基。細(xì)胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定過(guò)夜,PBS洗兩遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶（propidiumiodide,P

5、I）和1mg/mlRNaseA,室溫避光染色30min后上機(jī)檢測(cè)?！　?.5AnnexinVPI雙標(biāo)記法分析細(xì)胞凋亡率　　如上法收集藥物處理72h后的細(xì)胞，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用CELIQUEST軟件分析早期細(xì)胞凋亡率?！　?.6TUNEL法　　制作不同濃度不同時(shí)間作用后的細(xì)胞爬片,按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。　　1.7bcl2癌基因產(chǎn)物表達(dá)檢測(cè)　　將各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在不同藥物濃度下分別培養(yǎng)24h,48h,72h后，制成蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本，按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用圖像分析儀進(jìn)行分析。　　1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　　數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗(yàn)分析差異顯著性，采用P

6、earson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)?！　?結(jié)果　　2.1吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響　　吉西他濱不同濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率可按公式計(jì)算:腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%,可見(jiàn)各濃度組對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，差異有顯著性(P<0.05），見(jiàn)圖1?！　D1吉西他濱對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)抑制作用（略）　　2.2吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞周期的影響　　在藥物作用72h，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例不斷增高，處于S期細(xì)胞比例降低，對(duì)細(xì)胞周期有明顯影響，將細(xì)胞

7、阻滯與G0/G1期，見(jiàn)表1?！　”?不同濃度吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（略）　　2.3AnnexinVPI聯(lián)合雙染測(cè)凋亡率　　結(jié)果顯示，作用72h后，各濃度吉西他濱處理的細(xì)胞的凋亡率分別為(4.97±0.4)%、(8.06±0.7)%、(14.67±0.5)%、(30.59±1.1)%、(38.88±0.8)%、(41.32±1.2)%相關(guān)性分析顯示藥物濃度與凋亡發(fā)生呈正相關(guān)，即隨著藥物濃度增加細(xì)胞凋亡增加?！　?.4TUNEL檢測(cè)　　陰性組僅見(jiàn)藍(lán)灰色的凋亡陰性染色吉西他