革蘭陰性桿菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的分布及基因型

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1、革蘭陰性桿菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的分布及基因型作者：孟靈張潤(rùn)玲尤崇革王應(yīng)芳【摘要】　　目的：了解臨床分離的革蘭陰性桿菌中產(chǎn)ESBLs的流行特征及ESBLs基因型.方法：對(duì)我院臨床分離的革蘭陰性桿菌，采用改良三維試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株，用PCR對(duì)ESBLs基因進(jìn)行分型.結(jié)果：175株革蘭陰性桿菌分離出49株產(chǎn)ESBLs菌，陽(yáng)性率28%，包括大腸埃希菌、克雷伯菌屬、陰溝腸桿菌、弗勞地枸椽酸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌.其中，第一位是陰溝腸桿菌（34.7%，17/49），其次是大腸埃希菌（30.6%，15/49）.每種細(xì)菌產(chǎn)ESBLs率前三位是陰溝腸桿菌（56.6%，17/30），大腸

2、埃希菌（37.5%，15/40），肺炎克雷伯菌（25.0%，6/24）.各病區(qū)中神經(jīng)科產(chǎn)ESBLs菌分離率最高(32.7%).49株產(chǎn)ESBLs菌攜帶TEM，SHV，CTXM分別為34，5，16株，有17株同時(shí)攜帶兩種β內(nèi)酰胺酶基因的菌株，占34.7%,其中TEM+CTXM型13株，占基因雙陽(yáng)性菌株的76.5%.結(jié)論：我院產(chǎn)ESBLs菌以陰溝腸桿菌、大腸埃希菌為主.神經(jīng)科是主要產(chǎn)ESBLs菌的病區(qū).ESBLs基因以TEM型、CTXM型為主，攜帶雙基因的菌株在我院有流行.【關(guān)鍵詞】革蘭陰性桿菌β內(nèi)酰胺酶類(lèi)三維試驗(yàn)基因型0引言超廣譜β內(nèi)酰胺酶（Extendedspectrum

3、betalactamases，ESBLs）是質(zhì)粒介導(dǎo)的由β內(nèi)酰胺酶(BLA)基因突變而形成的一類(lèi)酶，是絲氨酸蛋白酶的衍生物.它可水解頭孢噻肟(CTX)，頭孢他啶(CAZ)等三代頭孢菌素和單環(huán)酰胺類(lèi)抗生素，并可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸）抑制［1］.自1983年德國(guó)首次從臭鼻克雷伯桿菌中分離出SHV2基因型ESBL以來(lái)，其數(shù)量及種類(lèi)已在世界各地迅速增長(zhǎng).ESBLs基因型主要分為SHV,TEM,CTXM,OXA型和其他型，目前已發(fā)現(xiàn)200多種(.lahey.org/studies/).不同的國(guó)家、地區(qū)、醫(yī)院因其使用抗生素的種類(lèi)和劑量不同,產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的檢出率、耐藥性、基因

4、型也有所差異.為了解蘭州大學(xué)第二醫(yī)院革蘭陰性桿菌產(chǎn)ESBLs的流行狀況和基因分型，我們對(duì)49株革蘭陰性桿菌進(jìn)行了ESBLs的確認(rèn)及其基因型測(cè)定.1材料和方法1.1材料頭孢噻肟（CTX，30μg/片），頭孢硝噻吩紙片（Nitrocefin），MH瓊脂購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司；克拉維酸（山西威奇達(dá)藥業(yè)有限公司）,氯唑西林(山西博康藥業(yè)有限公司)；TaKaRa質(zhì)粒DNA純化盒，TaKaRaPCR擴(kuò)增盒，DNAMarkerD3405A，引物購(gòu)自寶生物（大連）有限公司.PCR分析儀（美國(guó)PERKINELMER），凝膠成像儀（德國(guó)Herolab），ABIDNA測(cè)序儀（美國(guó)PE），電泳儀（北京六一儀

5、器廠）.大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌700603（衛(wèi)生部臨檢中心）.200505～09我院臨床分離菌175株革蘭陰性桿菌.1.2方法1.2.1改良三維試驗(yàn)對(duì)待測(cè)菌株利用凍融法獲取粗酶提取液，濾菌器過(guò)濾后測(cè)定β內(nèi)酰胺酶呈陽(yáng)性待用.將CTX紙片貼于涂布了大腸埃希菌ATCC25922的MH平板中央，具其5mm處用刀片向外分別切四個(gè)裂隙，在各裂隙中分別加入待測(cè)粗酶液（30μL），粗酶液（30μL）+克拉維酸液（2mmol/L10μL），粗酶液（30μL）+氯唑西林液（2mmol/L10μL），粗酶液（30μL）+克拉維酸液（2mmol/L10μL）+氯唑西林液（2mmol/

6、L10μL），35℃過(guò)夜培養(yǎng).1.2.2ESBLs基因型酶（TEM,SHV,CTXM1型）PCR擴(kuò)增①引物設(shè)計(jì)：TEM型T1(5′ATAAAATTCTTGAAGACGAAA3′),T2(5′GACAGTTACCAATGCTTAATCA3′)，終產(chǎn)物1075bp；SHV型S1(5′GGGTTATTCTTATTTGTCGC3′),S2(5′TTAGCGTTGCCAGTGCTC3′)，終產(chǎn)物928bp；CTXM1型C1(5′GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC3′),C2(5′CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTCG3′)終產(chǎn)物826bp

7、.②質(zhì)粒提取：挑選待測(cè)菌單個(gè)菌落接種至2.5mL含有氨芐西林(50mg/L)的LB培養(yǎng)基35℃過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)23000g離心2min，沉淀物采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA.③反應(yīng)體系：引物各0.25μL，10×PCRBuffer(+)(Mg2+PLus)5μL，dNTP4μL，Taq酶0.25μL，質(zhì)粒模板2μL，加去離子水至50μL.④反應(yīng)參數(shù)：TEM型變性94℃45s，退火50℃45s，延伸72℃1min共30個(gè)循環(huán)；SHV型變性94℃30s，退