rna干擾egfr基因?qū)β殉舶┘?xì)胞化療敏感性的影

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1、RNA干擾EGFR基因?qū)β殉舶┘?xì)胞化療敏感性的影【摘要】目的構(gòu)建表皮生長因子受體(EGFR)基因的小干擾RNA（siRNA）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株skov3后檢測RNA干擾（RNAi）對EGFR基因表達(dá)及細(xì)胞對化療藥物敏感性的影響。方法體外構(gòu)建EGFR小發(fā)卡狀RNA（shRNA）的表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體法介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染入skov3細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、非特異性轉(zhuǎn)染組和特異性轉(zhuǎn)染組。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測EGFRmRNA的表達(dá)，使用免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測EGFR蛋白的表達(dá)。使用四甲基偶氮

2、唑藍(lán)法（MTT）測定EGFRshRNA轉(zhuǎn)染skov3細(xì)胞后細(xì)胞對順鉑敏感性的改變。結(jié)果EGFRshRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞EGFRmRNA的表達(dá)與其他兩組相比明顯減弱（F=87.73，q=16.81、15.33,P<0.01）,EGFR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（F=69.29，q=14.71、13.57，P<0.01）；順鉑敏感性比正常對照組提高了約3倍。結(jié)論靶向EGFR基因的序列特異性shRNA可有效抑制skov3細(xì)胞中EGFR基因的表達(dá)，增強(qiáng)skov3細(xì)胞對順鉑的敏感性?！娟P(guān)鍵詞】卵巢腫瘤;受體,表皮生長因子

3、;RNA干擾;順鉑　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructexpressionvectorofEGFRspecificsiRNAandtransfectitintohumanovariancancercelllineskov3andtheninvestigatetheeffectofRNAinterference(RNAi)onthetargetgeneexpressionandchemosensitivityofthecellline.MethodsEGFRshRNAalcontro

4、lcelllineandnonspecifictransfectantcelllinemunocytochemistryedtodetecttheinhibitiveeffectofRNAionmRNAlevelandproteinlevel,respectively.Thechemosensitivitytocisplatinethod.ResultsTheexpressionofEGFRmRNAofsequencespecificshRNAtargetingEGFRehappenedtotheprote

5、inexpression(F=69.29；q=14.71,13.57；P<0.01),osensitivitytocisplatines.ConclusionTheEGFRspecificshRNAexpressionvectorcaneffectivelysuppresstheexpressionlevelofEGFRgeneofskov3cells,andincreasesitschemosensitivitytocisplatin.［KEYidiprepSystem試劑盒的步驟提取并純化質(zhì)粒待轉(zhuǎn)染

6、。　　1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)　　skov3細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清、105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RMPI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察記錄細(xì)胞的生長狀態(tài)。　　1.2.4轉(zhuǎn)染　　采用HifectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，按操作說明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、非特異性轉(zhuǎn)染組和特異性轉(zhuǎn)染組。正常對照組細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)；非特異性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染由Ambion公司質(zhì)粒試劑盒所提供的非特異性質(zhì)粒；特異性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pEGFRshRNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1d

7、將細(xì)胞接種至6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞約80％匯合，將構(gòu)建好的質(zhì)粒與HifectinⅡ混合成轉(zhuǎn)染復(fù)合物(質(zhì)粒質(zhì)量∶HifectinⅡ體積=1∶1.5),加入細(xì)胞中輕柔搖勻，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中孵育24h后1∶2傳代，加300mg/L的G418篩選，3周后獲抗G418的陽性克隆，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。　　1.2.5RTPCR檢測轉(zhuǎn)染前后skov3細(xì)胞EGFRmRNA的表達(dá)　　按Trizol試劑說明書的要求提取細(xì)胞總RNA，按ReverseTranscriptio

8、nSystem的說明書采用特異性下游引物法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。EGFR上游引物：5′AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT3′；EGFR下游引物：5′GGAAGTCCATCGACATGTTGCT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長262bp。以βactin為內(nèi)參照，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)25次后，72℃延伸10min。15g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外線透射觀察儀