丙泊酚對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響

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1、丙泊酚對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響作者：付笑飛趙松劉東雷王建軍【摘要】　　目的探討丙泊酚對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷（LIRI）細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響。方法雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組（IR組）、丙泊酚組（P組）。IR組、P組均建立大鼠原位肺缺血再灌注模型（缺血1h，再灌3h），P組于缺血前30min靜脈輸注丙泊酚5mg·kg-1·h-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取左肺標(biāo)本，用免疫組化法檢測(cè)Bcl2與Bax蛋白表達(dá)情況，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）法檢測(cè)肺上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），同時(shí)光鏡下

2、觀察肺組織的病理學(xué)變化。結(jié)果與S組相比，IR組凋亡指數(shù)增加，肺組織中Bcl2、Bax表達(dá)均增強(qiáng)，Bcl2/Bax比值明顯降低(P＜0.05)；與IR組相比，P組Bcl2蛋白表達(dá)增加、Bax蛋白表達(dá)減少和細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P＜0.05)，光鏡下肺組織病理學(xué)變化明顯輕于IR組。結(jié)論丙泊酚對(duì)大鼠LIRI具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控Bcl2/Bax蛋白表達(dá)從而減輕肺細(xì)胞凋亡有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】丙泊酚；肺缺血再灌注；凋亡　　在肺缺血再灌注損傷（lungischemiareperfusioninjury，LIRI）的過(guò)程中細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺組

3、織損傷的重要原因之一〔1〕。丙泊酚（propofol）是臨床常用的靜脈麻醉藥，已有研究表明其對(duì)LIRI有一定的保護(hù)作用〔2〕，但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)建立大鼠在體LIRI模型，觀察丙泊酚對(duì)LIRI肺細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響，并探討其可能機(jī)制?！　?材料與方法　　1.1材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　　清潔級(jí)健康雄性SD大鼠42只，體重250～300g（同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供）。主要試劑：鼠抗Bcl2、Bax抗體（SantaCruz公司，美國(guó)）、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）試劑（Roche公司，德國(guó)）、二步法免疫組化檢測(cè)試劑（PV60

4、01）(北京中杉金橋生物科技有限公司)。主要藥物：丙泊酚注射液（AstraZeneca公司，意大利）。　　1.2方法　　1.2.1動(dòng)物分組及模型制備　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組14只，分別為：假手術(shù)組(S組)，除不作缺血處理外，余同其他組；肺缺血再灌注組（IR組），缺血1h，再灌3h；丙泊酚組（P組），缺血前30min靜脈輸注丙泊酚5mg/kg·h-1，缺血1h，再灌3h。IR組和P組每組又分為兩個(gè)亞組，再灌時(shí)間分別為1、3h，每個(gè)亞組7只大鼠。實(shí)驗(yàn)前4h禁食，腹腔注射4%戊巴比妥50mg/kg麻醉后，仰臥位固定。行頸部氣管切開(kāi)、插

5、管，并游離右側(cè)頸靜脈和頸動(dòng)脈。接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣維持呼吸，右側(cè)經(jīng)靜脈插管、固定，接微量注射泵；然后左側(cè)第5肋間開(kāi)胸，鈍、銳性結(jié)合游離左肺門(mén)。靜息5min后，于呼氣末用無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷左左主支氣管、左肺動(dòng)脈和左肺靜脈。阻斷1h后開(kāi)放，進(jìn)行再灌注1、3h。于1、3h實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)扎肺門(mén)取出左肺待用?！　?.2.2肺組織Bcl2、Bax蛋白檢測(cè)　　采用二步免疫組織化學(xué)法（PV）法檢測(cè)Bcl2、Bax蛋白的表達(dá)情況。各組標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋切片，嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行操作，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色，陰性對(duì)照組用PBS代

6、替一抗。在顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用MIAS2000圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性區(qū)域平均光密度值（OD），以O(shè)D值大小代表陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的多少?！　?.2.3原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)　　　　用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。光鏡下觀察細(xì)胞核染為棕黃色為凋亡細(xì)胞。每例標(biāo)本的切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（40×10），按凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%計(jì)算?！　?.2.4肺組織病理學(xué)檢測(cè)　　4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下（×200）進(jìn)行觀察?！　?.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件

7、分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。　　2結(jié)果　　2.1肺組織Bcl2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl2/Bax比值變化　　與S組相比，IR組、P組肺組織Bcl2、Bax蛋白含量均明顯增加（P<0.05）；與IR組相比，P組Bcl2蛋白表達(dá)明顯增加，Bax表達(dá)減少（P<0.05），見(jiàn)表1。表1再灌注后不同時(shí)相Bcl2、Bax蛋白（OD值）及Bcl2/Bax比值變化(略)　　2.2肺細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）變化　　與S組相比，IR組、P組肺AI值均明顯增加（P<0.05）；與IR組相比，P組各時(shí)

8、相AI值減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IR組、P組各組內(nèi)各時(shí)相均以再灌注3h時(shí)AI值最高，見(jiàn)表2。表2再灌注后不同時(shí)相肺細(xì)胞AI值變化(x±s)　　2.3肺組織病理學(xué)檢查　　光鏡下觀察HE染色病理切片，S