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1、FHIT基因轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2的作用【關(guān)鍵詞】肝癌RoleoftransfectionofFHITgeneinhumanhepatocellularcarcinomacelllineHepG2 【Abstract】AIM:TostudytheroleoftransfectionofFHITgeneintoahumanlivercancercelllineHepG2.METHODS:FHITgeneanlivercancercelllineHepG2bylipofectamine.Afterselectionmunochemistryand).Themorphologic
2、alchangesicroscope.RESULTS:StableexpressionofFHITprotEinintransfectedHepG2cellsissionelectronmicroscopeandfloetryshoSphasetoG2phase.CONCLUSION:TheresultsindicatethatFHITgenecaninhibitthegroa 【摘要】目的：探討外源性FHIT基因的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的影響.方法：用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pcDNA3.1FHIT及空載體pcDNA3.1(+)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞系HepG2中，G418選擇培養(yǎng)，經(jīng)免疫組
3、化和EM培養(yǎng)液中，CO2孵箱，37℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)候收獲細(xì)胞.將細(xì)胞爬片用10mmol/LPBS洗2min×2，丙酮固定20min.10mmol/LPBS洗4min×2，作細(xì)胞爬片HE染色.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，接種于100mL培養(yǎng)瓶中.待細(xì)胞鋪滿瓶底的80%時(shí)，胰蛋白酶消化，10mmol/LPBS洗滌，收集細(xì)胞于Ep管內(nèi)，40g/L戊二醛4℃固定過(guò)夜，包埋時(shí)用10mmol/LPBS洗3次，每次10min.10g/L鋨酸固定4℃,1h，系列丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，修塊，制備超薄切片，鈾鉛雙重染色，透射電鏡觀察并照相. 1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)特性分析取對(duì)數(shù)
4、生長(zhǎng)期的pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液.分別接種于24孔培養(yǎng)板，1×104細(xì)胞/孔.從接種2d起，每24h用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)孔計(jì)3次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每種細(xì)胞設(shè)4個(gè)平行孔，取其平均值.以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，接種于100mL培養(yǎng)瓶中.待細(xì)胞80%鋪滿時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶0.2g/LEDTA液消化，使細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液，10mmol/LPBS洗3次，收集細(xì)胞加入4℃預(yù)冷的700mL/L乙醇10mmol/LPBS，吹打均勻
5、，4℃固定2h以上.10mmol/LPBS洗滌1次，用含10mL/LTritonX100，0.1g/LRnase酶處理細(xì)胞30min.5g/L碘化丙（PropidiumIodide，PI）4℃，20min，過(guò)300目尼龍網(wǎng).上流式細(xì)胞儀測(cè)定在488nm波長(zhǎng)下DNA含量，用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期分布. 2結(jié)果 轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取及純化的質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT，經(jīng)測(cè)序證實(shí)FHIT序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的FHIT序列完全一致.pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞在胞質(zhì)中可見棕黃色染色，pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的HepG2細(xì)胞未
6、見明顯染色，提示FHIT蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中（Fig1）.pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞裂解液通過(guò)r17000的蛋白條帶（Fig2），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組中未檢測(cè)到FHIT蛋白的表達(dá).證實(shí)了構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1FHIT經(jīng)轉(zhuǎn)染后可在肝癌細(xì)胞HepG2中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FHIT蛋白. 2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)細(xì)胞爬片的HE染色經(jīng)生物顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染FHIT基因組細(xì)胞形態(tài)與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均伸展良好，3種細(xì)胞均呈多梭A:HepG2cells;B:pcDNA3.1HepG2cells; 形或多角形，大小不等，可見核分裂像及多個(gè)核仁，未見
7、明顯變化.透射電鏡觀察，轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，細(xì)胞圓形、卵圓形較多，細(xì)胞表面微絨毛均較豐富，細(xì)胞核大，核質(zhì)比例大，核的異形性明顯，呈腎形、馬蹄形，有些凹陷.胞質(zhì)透亮，染色質(zhì)分布均勻，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可見2～3個(gè)核仁.核分裂較多見.與轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染FHIT組細(xì)胞大小不等，細(xì)胞表面的微絨毛減少.核仁明顯，核染色質(zhì)輕度邊集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，線粒體聚集，細(xì)胞質(zhì)可見較多空泡、溶酶體及糖原（Fig3）. 2.2細(xì)胞生長(zhǎng)特性未轉(zhuǎn)染組和空載
