蛋白酶體抑制劑dci對胃癌細(xì)胞增殖的影響

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1、蛋白酶體抑制劑DCI對胃癌細(xì)胞增殖的影響【摘要】目的:探討蛋白酶體抑制劑3，4二氯異香豆素(DCI)對人胃癌細(xì)胞系BGC823體外增殖和凋亡的影響。方法:將DCI加入BGC823胃癌細(xì)胞,采用MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制效應(yīng),AnnexinⅤ/PI法及電鏡觀察DCI對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果:DCI可明顯抑制BGC823細(xì)胞體外增殖,隨著DIC濃度的增加和處理時間的延長,細(xì)胞凋亡率增加;流式細(xì)胞術(shù)顯示DCI可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞早期凋亡，細(xì)胞被阻滯在G1期；電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)DCI處理后的部分細(xì)胞具有凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)特征。結(jié)論:DCI可抑制人胃癌BGC823細(xì)胞增殖并促進其凋亡。【

2、關(guān)鍵詞】蛋白酶體抑制劑;胃癌;細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖　泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasomepatharin,DCI)同樣具有抑制蛋白酶體的功能，對腫瘤細(xì)胞也有抑制作用，本研究觀察其對胃癌細(xì)胞生長增殖的影響。　　1材料與方法　　1.1材料　　1.1.1細(xì)胞與培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC823購自上海細(xì)胞中心，置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用時以0.25%胰蛋白酶消化?！　?.1.2試劑DCI購自SantaCruz公司，溶于二甲基亞砜(DMSO)中,配成濃度為50mmol·L-1的貯存液,4℃保存,用時稀釋；四甲基偶

3、氮唑藍(MTT)為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；流式細(xì)胞儀為美國BD公司FACScalibur型號；酶標(biāo)儀為BIORED550型?！　?.2方法　　1.2.1MTT法測細(xì)胞生長抑制效應(yīng)取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板,每孔5×103個細(xì)胞,孵育過夜后,實驗組分別予終濃度為25、50、100、200、400、600、800μmol·L-1DCI,對照組予不含DCI的培養(yǎng)液,每組設(shè)3個復(fù)孔,各組分別培養(yǎng)6、12、24、48h,用MTT法測每孔吸光度（A）值?！　?.2.2AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期分布實驗組分別用終

4、濃度為150、300μmol·L-1的DCI處理BGC823細(xì)胞,對照組予不含DCI的培養(yǎng)液,均繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞,用PBS洗2次,采用AnnexinⅤ和PI熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)定量分析細(xì)胞凋亡狀況及周期分布?！　?.2.3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察收集經(jīng)300μmol·L-1的DCI處理24h后的BGC823細(xì)胞及未經(jīng)DCI處理的對照組細(xì)胞,戊二醛和鋨酸雙重固定,乙醇、丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察?！　?.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x-±s表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件Probit(概率單位法)計算，并行線性回歸分析?！　?結(jié)果　　2.

5、1DCI對胃癌細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，100～800μmol·L-1的DCI對胃癌細(xì)胞均有抑制作用，見表1,12、24h的IC50分別為478和398μmol·L–1。24h回歸方程為Y=-000104X±0.91476,其中Y、X分別為細(xì)胞率和DCI的濃度。Y和X的相關(guān)系數(shù)r為0.98,P<0.01?！　”?MTT法檢測DCI對胃癌細(xì)胞增殖的影響（略）　　2.2DCI對BGC823細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響DCI作用于BGC823細(xì)胞24h后收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,各個周期細(xì)胞百分比改變見圖1。150和300μmol·L–1濃度的DCI處理

6、BGC823細(xì)胞,G0/G1期細(xì)胞增加,而G2和S/M期細(xì)胞明顯減少（表2）。圖2表示DCI作用24h后細(xì)胞的凋亡率。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，正常培養(yǎng)的BGC823細(xì)胞凋亡率為2.54%，而經(jīng)150μmol·L–1DCI作用后,凋亡率已達18.27%,G1期前出現(xiàn)凋亡峰，DCI濃度為300μmol·L-1時,細(xì)胞凋亡率達23.86%,顯示DCI誘導(dǎo)的BGC823細(xì)胞凋亡具有量效關(guān)系?！　?.3透射電鏡觀察結(jié)果對照組細(xì)胞體積大,細(xì)胞器豐富,染色質(zhì)均勻(圖3A)。經(jīng)DCI作用后部分BGC823細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞體積縮小,胞漿濃縮,細(xì)胞器減少,出現(xiàn)空泡，染色質(zhì)固縮、邊緣

7、化,并形成凋亡小體(圖3B)?！　?討論　　蛋白酶體抑制劑可有效地誘導(dǎo)惡性、增殖程度高的細(xì)胞凋亡,對正常細(xì)胞幾乎無作用,從而成為治療腫瘤的新途徑[6]。DCI最初是作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，隨后有多項研究顯示DCI對UPP有明顯抑制作用。早老素可以誘導(dǎo)AlzhEimer病發(fā)生，其降解主要依靠蛋白酶體系統(tǒng)降解，蛋白酶體抑制MG132可以抑制早老素的降解，DCI也可以抑制其降解，但效率較MG132低，而同樣作為廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑的AEBSF對早老素降解無作用[7]。DCI還可抑制泛素化的生長相關(guān)蛋白GAP4