micrornas在小鼠內耳發(fā)育過程中差異表達及其對毛細胞分化作用的研究

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1、中IIJ大學博士論文microRNAs在小鼠內耳發(fā)育過程中的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究microRNAs在小鼠內耳發(fā)育過程中的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究專業(yè)：耳鼻H因喉科學博士研究生：王仙仁導師：姜鴻彥教授中文摘要研究目的：毛細胞損傷性耳聾是臨床常見病多發(fā)病，目前還沒有較好的治療方法。本研究試圖通過觀察不同發(fā)育階段小鼠內耳微RNA(microRNAmiRNA)表達特征及變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)潛在的可能與毛細胞發(fā)牛和成熟有關的miRNA。體外研究某～migNA對內耳發(fā)育和毛細胞分化成熟的影響，可以更好的探討miRN

2、A的作用機制，但目前世界上還沒有建立可以穩(wěn)定傳代的非轉基因哺乳動物毛細胞或其前體細胞。本文體外分離小鼠E11．5耳泡、建立小鼠內耳前體干細胞模型，并誘導分化，研究在小鼠內耳有特異表達的miRNA對體外培養(yǎng)的內耳前體干細胞分化的影響，并探討其可能存在的機制。研究方法：提取12個受孕后13．5d(E13．5dpc)、E16．5dpc內耳總RNA，行miRNA芯片檢測；收集E8．5dpc、E10．5dpc、E12．5dpc、E14．5dpc、E16．5dpc、E18．5dpc胚胎內耳、新生C57BL／6小鼠內耳(P1)，做冰凍

3、切片，原位雜交檢測miR-182、miR一194、miR．140等多個重要的miRNA時空表達；提取12個E13．5dpc、E16．5dpc胚胎內耳、新生C57BL／6小鼠內耳(P1)總RNA，qRT-PCR檢測miR-i94、miR．183、miR．140等重要的miRNA表達。取孕后10．5—12．5d(El1．5dpc)C57BL／6胚胎，分離出耳泡，小心剔除周圍組織。中性蛋白酶、胰酶消化，37℃培養(yǎng)。7天后用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導細胞分化7天。收集分化和未分化細胞，RT-PCR檢測干細胞／毛細胞前體細胞、毛細胞標記

4、分子。免疫熒光檢測myosinIIVa，I中山大學博士論文microRNAs在小鼠內耳發(fā)育過程巾的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究Mathl，Jagged2，p27鼬p1，F(xiàn)-actin。掃描電鏡觀察分化前后細胞形態(tài)。從C57BL／6鼠肝臟中提取基因組DNA，擴增包含miR．183家族成員的PCR產(chǎn)物，并定向插入腺病毒穿梭載體pAdTrack．CMV。將經(jīng)pineI線性化的重組穿梭載體與腺病毒骨架質粒pAdEasy．1共轉化感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組獲得重組腺病毒質粒pAd．miR．182、pAd．miR

5、．183、pAd．miR-96。將pAd．miR在人胚腎293細胞(HEK293)中包裝并擴增出pAd．miR的重組腺病毒。從基因組DNA中擴增預測靶基因3'-UTRPCR產(chǎn)物，定向插入pRL．TK載體。用pAdTrack．CMV-miR、pRL．TK．utr、pGL-etl共轉染COS2細胞，雙熒光素酶法檢測雙熒光強度。qRT-PCR法檢測內耳前體干細胞誘導分化前后miR—182表達，轉染miR．182重組腺病毒、miR．182抑制劑，觀察其對內耳前體干細胞分化的影響，熒光免疫法檢測轉染前后Tbxl表達量。研究結果：m

6、iRNA芯片檢測了560個鼠miRNA，在耳蝸中有表達的有100多個，與E13．5dpc內耳表達的miRNA相比較，E16．5dpc有I／3表達量有變化，有56個miRNA表達差異在2倍以上。miR-140在耳泡形成期開始表達，先在kolliker器，Corti器，螺旋神經(jīng)節(jié)，前庭上均有表達，后特異性的表達在內外毛細胞，前庭毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)上。qRT-PCR檢測結果證實miR-140在內耳表達逐漸減少。miR-182與miR-140表達規(guī)律相似。耳泡體外分離培養(yǎng)3天后可以形成2種球，一種是實體球，一種空心球。RT-PC

7、R顯示未分化的球主要表達Abc92，nestin等干細胞Marker，分化后的球表達mathI，myosinIIVa等毛細胞Marker。免疫熒光證實，細胞球分化后表達mathl，myosinIIVa，細胞表面可見纖毛樣結構。限制性內切酶分析和DNA測序結果顯示，重組腺病毒穿梭載體pAdTrack．CMV-miR構建正確，pRL—TK．utr構建正確。在HEK293細胞中成功包裝并擴增出重組腺病毒rAd．miR-183、rAd．miR一182、rAd—miR．96。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實Tbxl是miR-182的靶基因之

8、一。內耳前體干細胞增殖期miR—182表達量改變不明顯，誘導分化后mR．182表達量明顯增加。miR．182重組腺病毒促進毛細胞分化，Tbxl表達明顯減少，miR．182抑制劑抑制毛細胞分化，Tbxl表達增強。II中l(wèi)IJ大學博土．論文microRNAs在小鼠內耳發(fā)育過程·扣的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究研究結