酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

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1、氨酸酶的提取及其催化活性研宄一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康臍蜃R(shí)生物體中酶的存在和催化作用，便學(xué)生了解生物體系中在酶存在下的合成或分解與普通的有機(jī)合成的不同和相同之處，認(rèn)識(shí)一些生物化學(xué)過(guò)程的特殊性。掌握生物活性物質(zhì)的提取和保存方法，學(xué)會(huì)使用儀器分析手段研究催化反應(yīng)特別是生物化學(xué)體系屮催化過(guò)程的基本思想和方法。二.實(shí)驗(yàn)原理在實(shí)驗(yàn)室里，復(fù)雜的有機(jī)物合成與分解往往要求在髙溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、減壓等劇烈條件下才能進(jìn)行。而在生物體內(nèi)，雖然條件溫和（常溫、常壓和接近屮性的溶液等），許多復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)卻進(jìn)行的十分順利和迅速，而II基本沒(méi)有副產(chǎn)物，其根本原因就是由于生物催化劑酶的存在。酶是具有催化作用的蛋白質(zhì)。按照酶的組成，可

2、將其分為兩類簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)其活性僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。如脲酶、淀粉酶等；（2）結(jié)合蛋白質(zhì)這種酶需要加入非蛋白質(zhì)組分（稱之為輔助因子）后，才能表現(xiàn)出酶的活性。酶蛋白質(zhì)與輔助因子結(jié)合形成的復(fù)合物稱為全酶，例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+為輔助因子的全酶。輔助因子雖然本身無(wú)催化作用，但參與氧化還原或起運(yùn)載酰基載體的作用。若將全酶屮的輔助因子除去，則酶的活性就失去了。H0多巴快吲哚醌酶參與的多巴轉(zhuǎn)換反應(yīng)黑色素通常把被酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物。一種酶催化特定的一個(gè)或一類成物的反應(yīng)，具有很高的選擇性和靈敏度，因而引起了廣大分析工作者的興趣。目前，酶己作為一種分析試劑得到應(yīng)用。特別是在生化、醫(yī)學(xué)方而

3、。例如一些生命物質(zhì)和液體中的特殊有機(jī)成分，用其他方法測(cè)定有困難，用酶法分析卻有其獨(dú)到之處。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)從土豆中提取酪氨酸酶并測(cè)定其活性，使同學(xué)們對(duì)酶有個(gè)初步的了解。我們都見過(guò)，當(dāng)土豆、蘋果、呑蕉、蘑菇受損傷時(shí)顯棕色的現(xiàn)象，這是由于土豆、蘋果等含有酪氨酸和酪氨酸酶。酶存在于物質(zhì)內(nèi)部，當(dāng)內(nèi)部物質(zhì)鉍露山來(lái)后，在空氣中的氧參與下，發(fā)生了如圖9-6-1所示的一系列反應(yīng)，生成黑色素。酪氨酸酶可用比色法測(cè)定。巾于多巴轉(zhuǎn)變成多巴紅速率很快，再轉(zhuǎn)到下一步產(chǎn)物速率慢得多，故可在酶存在下，測(cè)定多巴轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟图t的速率而測(cè)定酶的活性。（可用吸光度對(duì)時(shí)間作閣，從所得的直線斜率求酶的活性）。酶的活性計(jì)算：一般定義在優(yōu)

4、化的條件下（pH、離子強(qiáng)度等），25"C時(shí)在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1umol底物所需要的量為酶的活性單位。通過(guò)下式可計(jì)算出所用的酶的活性：M6a=——xio6ktV式中：為所用溶液的酶的活性，AA為扱大吸收處吸光度的變化，t為時(shí)間，k為多巴紅的摩爾吸收系數(shù)，V為加入的酶體積。進(jìn)而汁算出所用原料中的酶的活性：A=aV0/m式中：A為原料中酶的活性，Vo為原料所得的酶溶液的總體積，m為原料總質(zhì)量。一.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，水浴，秒表。2.試劑：二羥基苯丙胺酸（多巴），磷酸氫二鈉，鹽酸，sephedex柱，材料:土豆（或蘋果）。二.實(shí)驗(yàn)步驟1.熔液配制O.lOmol-L-1

5、磷酸緩沖溶液（pH=7.2）:50mL0.20mol?L-1磷酸氫二鈉+8mLO.lmol?L—1鹽酸，稀釋到200mL;O.lOmol*L_1磷酸緩沖溶液（pH=6.0）:50mL0.20mol磷酸氫二鈉+22mL0.1mol-L_,鹽酸，稀釋到200mL：O.OlOmol?L_1多巴溶液，稱取0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸緩沖溶液溶解并稀釋到lOOmLo2.酶的提取在研缽中放入10g切碎了的土豆，加入7.5mLpH=7.2的磷酸緩沖溶液，用力擠壓。用兩層紗布濾出提取液，立即離心分離（約3000rpm,5min）o傾出上層清液保存于冰浴或冰箱中。提取液為棕色，在放置過(guò)程中不斷變

6、黑。有條件的話，可以經(jīng)sephedex柱進(jìn)一步純化。1.多巴紅溶液的吸收光譜（選做）取0.4mL已稀釋過(guò)的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的緩沖液。加2mL多巴溶液，搖勻。反應(yīng)約10min后，使用丨cm比色池于掃描分光光度計(jì)上進(jìn)行重復(fù)掃描，即可獲得多巴紅的吸收光譜。若使用自動(dòng)掃描分光光度計(jì)，可從混合開始以時(shí)間間隔為1min進(jìn)行連續(xù)掃描，可以觀察到吸光度隨時(shí)間增加的現(xiàn)象。2.酶的活性測(cè)量取2.5mL上述提取液用pH=7.2的緩沖液稀釋至10mL比色管屮，搖勻。取0.1mL稀釋過(guò)的提取液于10mL比色管中，加入2.9mLpH=6.0的緩沖溶液，再加入2mL多巴溶液，同時(shí)幵始計(jì)時(shí)，用分光光

7、度計(jì)在480rnn處測(cè)定吸光度。開始6min內(nèi)每分鐘讀1個(gè)數(shù)，以后隔2min讀丨個(gè)數(shù)，直至吸光度變化不大為止。取0.2mL,0.3mL,0.4mLS稀釋過(guò)的提取液重上述實(shí)驗(yàn)，［注意總體積為5mL,每次換溶液洗比色皿只能倒很少fi溶液洗1次。以吸光度對(duì)時(shí)間作圖，從直線斜率求出酶的活性。一.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論1.不同酶加入量的動(dòng)力學(xué)曲線以吸光度值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)，可得出在加入酶的作用下多巴的轉(zhuǎn)換動(dòng)力學(xué)過(guò)程,再由直線部分得出轉(zhuǎn)換速率，即