單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡

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1、單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡【摘要】目的：研究單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVEC)凋亡的影響.方法：培養(yǎng)并鑒定hUVEC；用不同濃度MCP1（0.1,1.0,10,100μg/L）對其作用24，48h；AnnexinV/PI雙染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞染色體“DNAladder”的形成.結(jié)果：MCP1能誘導(dǎo)hUVEC的凋亡，其效應(yīng)隨濃度和時間的增加而增強(qiáng)(P0.01)；AnnexinV/PI顯示凋亡細(xì)胞明顯增加；細(xì)胞DNA呈明顯的“

2、DNAladder”.結(jié)論：MCP1能誘導(dǎo)hUVEC凋亡.【關(guān)鍵詞】單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白質(zhì)1；臍靜脈；內(nèi)皮細(xì)胞；動脈硬化；細(xì)胞凋亡　　動脈粥樣硬化(As)與血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）之間的關(guān)系密切，目前被普遍接受的“損傷反應(yīng)”學(xué)說〔1〕認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞功能性的損傷是As形成早期的始動環(huán)節(jié).有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色〔2〕.單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）是一種趨化激活劑，可以特異地作用于血液中的單核細(xì)胞，招引其遷移至內(nèi)皮下形成泡沫細(xì)胞.Selzman等〔3〕及官秀梅等〔4〕的研究發(fā)現(xiàn)，MCP

3、1不僅有趨化作用，而且可以作為一種生長因子促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，從而直接或間接地參與了As的形成，但MCP1對與As發(fā)生關(guān)系極為密切的內(nèi)皮細(xì)胞的生長有何影響尚少見相關(guān)報(bào)道，我們對此進(jìn)行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　人MCP1（Peprotech公司）；M199培養(yǎng)基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型膠原酶，EDTA（Sigma公司）；AnnexinVEGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，DNAladder檢測試劑盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗體、鼠抗人內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(KDR)

4、抗體（美國Dako公司）；超凈臺（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰空氣公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美國ThermoFormo公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）.　　1.2方法　　1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVEC）培養(yǎng)　　采用李琴山等〔5〕改良的酶消化法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ⅷ因子抗體（抗von199培養(yǎng)基，2mmol/LL谷氨酰胺；實(shí)驗(yàn)組（M1~M4組）：MCP1含量分別為0.1，1.0，10，100μg/L.　　1.2.3AnnexinV/P

5、I雙染流式細(xì)胞儀檢測　　早期凋亡率將hUVEC以1×106個/瓶接種于50mL無菌的培養(yǎng)瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后換為不同終濃度的MCP1應(yīng)用液，24，48h后用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率.　　1.2.4瓊脂糖凝膠電泳檢測　　DNAladder將hUVEC以1×106個/瓶接種于50mL無菌的培養(yǎng)瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后換為不同終濃度的MCP1應(yīng)用液，24，48h后按試劑盒說明書提取DNA，15g/L瓊脂糖凝膠電泳.電壓5V/cm，

6、電泳2.5h.在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照.　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，結(jié)果用x±s表示.　　2結(jié)果　　2.1細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定　　培養(yǎng)的細(xì)胞在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈典型的“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)特征（圖1）.Ⅷ因子mAb免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示95%為陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞胞質(zhì)為棕黃色.GAMFITC綠色熒光顯示膜上KDR（AntiVEGFrecepter2）和GARTR紅色熒光顯示胞內(nèi)的Ⅷ因子，免疫熒光雙標(biāo)顯示95%以上為陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞.證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、，并且純度符合實(shí)驗(yàn)要求.　　2.2AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀分析　　在0.1μg/LMCP1作用VEC24h即可明顯誘導(dǎo)hUVEC的早期凋亡，這種效應(yīng)隨MCP1用量增加和作用時間的延長而明顯增強(qiáng)（P0.01，表1）.表1不同濃度的MCP1作用hUVEC24，48h后AnnexinV/PI檢測早期凋亡（略）　　2.3MCP1對hUVEC作用　　后瓊脂糖凝膠電泳在1.0μg/L的MCP1作用24，48h時均未見“DNAladder”，而10μg/L和100μg/L的MCP1作用于hUVEC24，48

8、h后均可見“DNAladder”（圖2）.說明MCP1作用于hUVEC可引起凋亡，并且具有劑量依賴性.　　3討論　　血管內(nèi)皮細(xì)胞是參與As病理過程的重要細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明發(fā)生As的局部血管內(nèi)皮細(xì)胞更新加快，提示高頻率的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是As發(fā)生的第一步〔6〕，凋亡內(nèi)皮細(xì)胞的增加易改變內(nèi)皮的完整性和功能，從而誘發(fā)As〔7-8〕.因此VEC凋亡在As中的作用越來越受到關(guān)