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《結(jié)核分枝桿菌rpfa蛋白的表達(dá)純化與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、結(jié)核分枝桿菌RpfA蛋白的表達(dá)純化與鑒定作者：高輝，柏銀蘭，王麗梅，徐志凱，薛瑩【關(guān)鍵詞】RpfA；表達(dá)；純化；分枝桿菌,結(jié)核 Expression,purificationandidentificationofMycobacteriumtuberculosisRpfA 【Abstract】AIM:ToexpressefficientlyMycobacteriumtuberculosisRpfAinE.coliandpurifythefusionprotEins.METHODS:RpfAgenesegmentsHIandclon
2、edintopcDNA3.1+vector.Aftersequencing,RpfAidpET19bRpfAedintoE.coliDE3andinducedbyIPTGforitsexpression.TheRpfAfusionproteinexpressionedbyr約為80ku處有表達(dá)條帶，TB）的候選組分的可能性. 1材料和方法 1.1材料含RpfA基因片段的質(zhì)粒由MikeYoung教授惠贈(zèng)（Universityofillipore公司）；抗His標(biāo)簽mAb（北京天為時(shí)代公司）；小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血
3、清（切去His標(biāo)簽）為第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室制備. 1.2方法 1.2.1基因片段的測(cè)序鑒定將含有目的片段的質(zhì)粒用NdeI和BamHI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段條帶.再將純化的回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的pcDNA3.1+載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDE3，均勻涂布于含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定，將酶切正確的克隆送至上海博亞生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定. 1.2.2目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切后，回收目的片段，與經(jīng)同樣
4、酶切的pET19b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDE3，隨機(jī)挑取4個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定.把酶切鑒定正確的陽性克隆接種在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37℃振搖過夜，然后按1∶25的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37℃振搖3h后加入異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1.0mmoL/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h.取1.0mL細(xì)菌培養(yǎng)物，離心1min收集菌體，加入2×樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，100℃煮10min后12000g離心10min；取上清進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，并通過凝膠薄層掃描測(cè)定其表達(dá)量. 1.2.3表達(dá)產(chǎn)物鑒定所
5、構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)的RpfA蛋白是帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，而且表達(dá)的RpfA蛋白是與Rpf家族其它蛋白高度同源的，都含有關(guān)鍵的Rpf樣結(jié)構(gòu)域［6］.將經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)菌制成樣品，進(jìn)行100g/LSDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用10g/LBSA封閉過夜，分別加入抗組氨酸標(biāo)簽的特異性mAb，小鼠抗Rv1884免疫血清，小鼠抗Rv2389免疫血清作用1h，以10mmol/LPBS（pH7.2）洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作用1h，以DAB顯色觀察表達(dá)產(chǎn)物.分別以未誘導(dǎo)細(xì)菌裂解物，第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室制備的ESA
6、T6MPT64融合蛋白為陰性對(duì)照. 1.2.4表達(dá)蛋白的可溶性分析大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)菌，超聲波破碎細(xì)菌.12000g離心10min后將上清和沉淀分別制樣，進(jìn)行SDSPAGE分析. 1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化采用Invitrogen的Ni2+NTA純化試劑盒純化目的蛋白.將50mL的誘導(dǎo)菌液離心，制備上柱樣品，按照變性條件進(jìn)行親和色譜純化，收集洗脫液進(jìn)行SDSPAGE分析. 2結(jié)果 2.1RpfA基因片段的序列測(cè)定含有目的基因片段的質(zhì)粒用NdeI和BamHI雙酶切，得到大小約為1125bp的片段（圖1），將
7、回收后的目的片段克隆入pcDNA3.1+載體，挑選酶切鑒定正確的克隆，經(jīng)正反向全自動(dòng)測(cè)序后證實(shí)目的片段序列與切去N末端99bp信號(hào)肽編碼序列后的Genbank序列完全一致. M:DNAmarker(DL2000)；1:PlasmidRpfA. 圖1含RpfA基因片段質(zhì)粒酶切鑒定（略） 2.2表達(dá)載體的酶切鑒定將重組質(zhì)粒pcDNA3.1+RpfA經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切后，回收目的片段，與經(jīng)同樣酶切的pET19b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDE3，隨機(jī)挑取4個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定，其中2,3,4號(hào)克隆切出目的大小的片斷，
8、命名為pET19bRpfA2,3,4（圖2）. M:DNAmarker(DL2000)；1~4:pET19bRpfA質(zhì)粒. 圖2pET19bRpfA質(zhì)粒酶切鑒定（略） 2.3RpfA融合蛋白的表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDE3
