光氣吸入對大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響

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1、光氣吸入對大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響【摘要】目的：研究光氣吸入染毒前后大鼠肺組織基因表達(dá)的差異，探討光氣肺損傷作用相關(guān)的基因譜.方法：提取正常對照組和光氣染毒組肺組織的總RNA，并以此為模板制備熒光標(biāo)記的cRNA靶物，經(jīng)雜交、洗滌后，通過掃描熒光強(qiáng)度和計(jì)算機(jī)軟件分析，尋找染毒前后上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因.結(jié)果：在大鼠20500個(gè)靶基因中，初步篩選出801條差異表達(dá)基因，表達(dá)上調(diào)的有557條，下調(diào)的有254條.根據(jù)基因的生物學(xué)功能，差異表達(dá)基因被分為9類：G1自由基＼電子傳遞相關(guān)；G2應(yīng)激炎癥相關(guān)；G3物

2、質(zhì)代謝相關(guān)；G4細(xì)胞增殖＼分化＼凋亡相關(guān)；G5基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)；G6受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；G7蛋白質(zhì)修飾＼分解相關(guān)；G8細(xì)胞骨架＼運(yùn)動(dòng)相關(guān)；G9離子通道與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)等.結(jié)論：光氣可以引起肺組織基因的多發(fā)性改變，其差異表達(dá)基因的功能分類為進(jìn)一步探討光氣中毒發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和有效救治提供新的線索和思路.【關(guān)鍵詞】光氣；肺/損傷；寡核苷酸序列分析；基因表達(dá)　　光氣（phosgene,COCl2）又稱碳酰氯，屬于高毒類窒息性毒劑，是合成化工產(chǎn)品的重要原料，廣泛用于涂料、農(nóng)藥、塑料和紡織品等生產(chǎn)領(lǐng)域，由于揮發(fā)溫度

3、低（8.2℃）、分散度高、反應(yīng)快速，而被認(rèn)為是具有高度潛在危險(xiǎn)的恐怖武器［1-2］.光氣的主要毒性作用是對呼吸系統(tǒng)的損害，引發(fā)肺水腫［3］，但其中毒機(jī)制截至目前尚未完全闡明，臨床治療亦無特效措施［4-5］.我們利用基因芯片技術(shù)，探討光氣染毒后大鼠肺組織基因表達(dá)譜的改變以及差異表達(dá)基因與肺損傷的關(guān)系，旨在從新的角度對光氣中毒機(jī)制進(jìn)行闡述.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量145g～170g,（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；TRIzolReagent（美國Invitrogen公

4、司）；cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒（Lifegen公司）；RNA純化試劑盒（荷蘭Qiagen公司）；芯片雜交試劑盒（美國Agilent公司）；雜交箱（美國UVP公司，HL2000型）；芯片掃描儀（美國Axon公司，4000B型）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司，G800型）.　　1.2方法　　1.2.1樣本準(zhǔn)備　　將大鼠隨機(jī)分為對照組和染毒組，每組5只.正常組未在光氣中暴露，染毒組給予光氣染毒（38mg/L，1min）.4h后分別將兩組動(dòng)物按20mg/Kg用10g/L戊巴比妥鈉麻醉，充分暴露胸腔，左心房開放

5、后經(jīng)右心室沿肺動(dòng)脈注入無RNA酶的水對肺組織進(jìn)行灌洗以盡量排盡血液，最后在肺的同一部位剪取肺組織，經(jīng)TRIzol處理，迅速置于液氮中保存.　　1.2.2總RNA提取和cRNA擴(kuò)增　　標(biāo)記用RIzol試劑一步法抽提細(xì)胞總RNA，并用甲醛凝膠電泳，檢測總RNA樣本的質(zhì)量；用紫外分光光度計(jì)，分別在260nm，280nm處檢測cRNA的產(chǎn)量和純度.用cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒對靶物進(jìn)行Cy3或Cy5熒光標(biāo)記，用RNA純化試劑盒對標(biāo)記靶物進(jìn)行純化，分別在550nm，650nm處檢測Cy3和Cy5的熒光強(qiáng)度，以評估熒

6、光標(biāo)記效率.　　1.2.3芯片雜交實(shí)驗(yàn)　　芯片探針長度60mer，共包括22575個(gè)樣點(diǎn)，其中覆蓋大鼠基因20500個(gè)，positivecontrol探針913個(gè)，negativecontrol探針162個(gè)，空白探針1000個(gè).按照芯片雜交試劑盒提供的操作標(biāo)準(zhǔn)，將芯片和cRNA熒光標(biāo)記靶物進(jìn)行雜交.經(jīng)洗滌后，室溫500r/min離心10min，甩干芯片表面液體，取出后立即進(jìn)行掃描.　　1.2.4熒光掃描和數(shù)據(jù)處理　　將清洗甩干的芯片置于Axon4000B型掃描儀中，用Genepix3.0軟件進(jìn)行圖像掃描

7、，得到芯片雜交圖譜，讀取每個(gè)樣點(diǎn)的原始熒光信號數(shù)據(jù)，并對讀取的數(shù)據(jù)用Spotfire8.0軟件進(jìn)行分析，經(jīng)歸一化處理后，制作基因差異表達(dá)分析散點(diǎn)圖.導(dǎo)出上調(diào)基因和下調(diào)基因列表.判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)R≥2時(shí)表示基因上調(diào)；R≤0.5時(shí)表示基因下調(diào)；當(dāng)0.5　　1.2.5基因功能分類　　對符合基因差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)基因，通過連接基因庫權(quán)威網(wǎng)站：.ncbi.nlm.nih.gov和.geneoncology.org，進(jìn)行基因功能比對和分類，制作光氣染毒后肺組織的差異表達(dá)基因圖譜.　　2結(jié)果　　2

8、.1總RNA提取質(zhì)量　　RNA甲醛凝膠電泳顯示，28s，18s兩條帶清晰完整，證實(shí)提取的RNA無降解（圖1）.經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析，A260nm/A280nm值均為2.0，說明制備的RNA純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求.　　2.2cRNA標(biāo)記效率　　以效率大于8μmol/g視為標(biāo)記有效，計(jì)算得熒光標(biāo)記效率分別為9.81μmol/g和9.04μmol/g，符合參加雜交反應(yīng)的條件.　　2.3芯片雜交結(jié)果　　2.3.1差異表達(dá)基因　　經(jīng)對雙色熒光標(biāo)記雜交