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《光氣吸入對大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、光氣吸入對大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響【摘要】目的:研究光氣吸入染毒前后大鼠肺組織基因表達(dá)的差異,探討光氣肺損傷作用相關(guān)的基因譜.方法:提取正常對照組和光氣染毒組肺組織的總RNA,并以此為模板制備熒光標(biāo)記的cRNA靶物,經(jīng)雜交、洗滌后,通過掃描熒光強(qiáng)度和計(jì)算機(jī)軟件分析,尋找染毒前后上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因.結(jié)果:在大鼠20500個(gè)靶基因中,初步篩選出801條差異表達(dá)基因,表達(dá)上調(diào)的有557條,下調(diào)的有254條.根據(jù)基因的生物學(xué)功能,差異表達(dá)基因被分為9類:G1自由基\電子傳遞相關(guān);G2應(yīng)激炎癥相關(guān);G3物
2、質(zhì)代謝相關(guān);G4細(xì)胞增殖\分化\凋亡相關(guān);G5基因表達(dá)調(diào)控相關(guān);G6受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān);G7蛋白質(zhì)修飾\分解相關(guān);G8細(xì)胞骨架\運(yùn)動(dòng)相關(guān);G9離子通道與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)等.結(jié)論:光氣可以引起肺組織基因的多發(fā)性改變,其差異表達(dá)基因的功能分類為進(jìn)一步探討光氣中毒發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和有效救治提供新的線索和思路.【關(guān)鍵詞】光氣;肺/損傷;寡核苷酸序列分析;基因表達(dá) 光氣(phosgene,COCl2)又稱碳酰氯,屬于高毒類窒息性毒劑,是合成化工產(chǎn)品的重要原料,廣泛用于涂料、農(nóng)藥、塑料和紡織品等生產(chǎn)領(lǐng)域,由于揮發(fā)溫度
3、低(8.2℃)、分散度高、反應(yīng)快速,而被認(rèn)為是具有高度潛在危險(xiǎn)的恐怖武器[1-2].光氣的主要毒性作用是對呼吸系統(tǒng)的損害,引發(fā)肺水腫[3],但其中毒機(jī)制截至目前尚未完全闡明,臨床治療亦無特效措施[4-5].我們利用基因芯片技術(shù),探討光氣染毒后大鼠肺組織基因表達(dá)譜的改變以及差異表達(dá)基因與肺損傷的關(guān)系,旨在從新的角度對光氣中毒機(jī)制進(jìn)行闡述. 1材料和方法 1.1材料 SD大鼠10只,雌雄各半,體質(zhì)量145g~170g,(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);TRIzolReagent(美國Invitrogen公
4、司);cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒(Lifegen公司);RNA純化試劑盒(荷蘭Qiagen公司);芯片雜交試劑盒(美國Agilent公司);雜交箱(美國UVP公司,HL2000型);芯片掃描儀(美國Axon公司,4000B型);凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司,G800型). 1.2方法 1.2.1樣本準(zhǔn)備 將大鼠隨機(jī)分為對照組和染毒組,每組5只.正常組未在光氣中暴露,染毒組給予光氣染毒(38mg/L,1min).4h后分別將兩組動(dòng)物按20mg/Kg用10g/L戊巴比妥鈉麻醉,充分暴露胸腔,左心房開放
5、后經(jīng)右心室沿肺動(dòng)脈注入無RNA酶的水對肺組織進(jìn)行灌洗以盡量排盡血液,最后在肺的同一部位剪取肺組織,經(jīng)TRIzol處理,迅速置于液氮中保存. 1.2.2總RNA提取和cRNA擴(kuò)增 標(biāo)記用RIzol試劑一步法抽提細(xì)胞總RNA,并用甲醛凝膠電泳,檢測總RNA樣本的質(zhì)量;用紫外分光光度計(jì),分別在260nm,280nm處檢測cRNA的產(chǎn)量和純度.用cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒對靶物進(jìn)行Cy3或Cy5熒光標(biāo)記,用RNA純化試劑盒對標(biāo)記靶物進(jìn)行純化,分別在550nm,650nm處檢測Cy3和Cy5的熒光強(qiáng)度,以評估熒
6、光標(biāo)記效率. 1.2.3芯片雜交實(shí)驗(yàn) 芯片探針長度60mer,共包括22575個(gè)樣點(diǎn),其中覆蓋大鼠基因20500個(gè),positivecontrol探針913個(gè),negativecontrol探針162個(gè),空白探針1000個(gè).按照芯片雜交試劑盒提供的操作標(biāo)準(zhǔn),將芯片和cRNA熒光標(biāo)記靶物進(jìn)行雜交.經(jīng)洗滌后,室溫500r/min離心10min,甩干芯片表面液體,取出后立即進(jìn)行掃描. 1.2.4熒光掃描和數(shù)據(jù)處理 將清洗甩干的芯片置于Axon4000B型掃描儀中,用Genepix3.0軟件進(jìn)行圖像掃描
7、,得到芯片雜交圖譜,讀取每個(gè)樣點(diǎn)的原始熒光信號數(shù)據(jù),并對讀取的數(shù)據(jù)用Spotfire8.0軟件進(jìn)行分析,經(jīng)歸一化處理后,制作基因差異表達(dá)分析散點(diǎn)圖.導(dǎo)出上調(diào)基因和下調(diào)基因列表.判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)R≥2時(shí)表示基因上調(diào);R≤0.5時(shí)表示基因下調(diào);當(dāng)0.5 1.2.5基因功能分類 對符合基因差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)基因,通過連接基因庫權(quán)威網(wǎng)站:.ncbi.nlm.nih.gov和.geneoncology.org,進(jìn)行基因功能比對和分類,制作光氣染毒后肺組織的差異表達(dá)基因圖譜. 2結(jié)果 2
8、.1總RNA提取質(zhì)量 RNA甲醛凝膠電泳顯示,28s,18s兩條帶清晰完整,證實(shí)提取的RNA無降解(圖1).經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析,A260nm/A280nm值均為2.0,說明制備的RNA純度較高,符合實(shí)驗(yàn)要求. 2.2cRNA標(biāo)記效率 以效率大于8μmol/g視為標(biāo)記有效,計(jì)算得熒光標(biāo)記效率分別為9.81μmol/g和9.04μmol/g,符合參加雜交反應(yīng)的條件. 2.3芯片雜交結(jié)果 2.3.1差異表達(dá)基因 經(jīng)對雙色熒光標(biāo)記雜交