卵泡刺激素受體在成年化療大鼠卵巢中的表達(dá)

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1、卵泡刺激素受體在成年化療大鼠卵巢中的表達(dá)作者：羅璐，楊冬梓，王箴，莫亞勤，楊煒敏【摘要】目的：探討化療藥物所致的卵巢病理?yè)p傷以及FSHR在化療卵巢中的表達(dá).方法：將成年大鼠隨機(jī)分為兩組：生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組.大鼠單次腹腔注射環(huán)磷酰胺,觀察卵巢形態(tài)學(xué)改變并計(jì)數(shù)卵泡數(shù)目.熒光定量PCR方法檢測(cè)大鼠卵巢FSHRmRNA的表達(dá).結(jié)果：環(huán)磷酰胺可引起原始卵泡大量丟失，卵巢間質(zhì)嚴(yán)重?fù)p害，且卵巢局部發(fā)生纖維化.化療組卵巢竇卵泡比例顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；化療組大鼠動(dòng)情周期日數(shù)［（6.83±1.12）

2、d］顯著高于對(duì)照組［(4.50±0.82)d，P<0.05］.熒光定量PCR顯示，環(huán)磷酰胺組FSHRmRNA水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）.結(jié)論：化療大鼠卵巢FSHR表達(dá)減少，可能是導(dǎo)致化療卵巢局部竇卵泡比例減少和動(dòng)情周期延長(zhǎng)的原因之一.【關(guān)鍵詞】藥物療法；卵巢；受體，F(xiàn)SH；熒光定量PCR0引言臨床上，女性癌癥患者在接受化療藥物后多短暫性閉經(jīng)，隨之月經(jīng)恢復(fù)，但日后月經(jīng)紊亂和卵巢早衰的發(fā)生率顯著升高［1］.一般認(rèn)為，化療影響卵巢功能的機(jī)制有兩種可能:一為直接影響卵巢激素產(chǎn)生，二為干擾甾

3、體激素效應(yīng)，即通過(guò)作用于下丘腦或者垂體而發(fā)揮其干預(yù)作用.最近的幾組臨床資料顯示了接受化療的婦女其卵巢局部雌激素水平顯著降低［2］.近年研究發(fā)現(xiàn),卵泡刺激素受體(folliclestimulatinghormonereceptor,FSHR)基因與卵泡的發(fā)育、雌激素的產(chǎn)生以及性腺的狀態(tài)密切相關(guān)；卵巢的反應(yīng)性亦與卵巢局部FSHR表達(dá)水平的高低有關(guān)［3］.本研究以大鼠為模型，檢測(cè)化療卵巢局部FSHR的表達(dá)情況,以期深入探討化療藥物損傷卵巢的具體機(jī)制.1材料和方法1.1材料健康6g/kg）.大鼠一次性接受腹腔

4、注射生理鹽水或環(huán)磷酰胺;注射時(shí)注意每次從同一位置同一角度進(jìn)針.1.2方法1.2.1卵巢處理于術(shù)后8RNA.取自制微細(xì)棉簽蘸以生理鹽水后,輕輕于大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)1圈,行陰道涂片,用950mL/L乙醇固定5min,HE染色,顯微鏡下觀察,以確定發(fā)情周期.術(shù)后8切片，間隔切片計(jì)數(shù).初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇狀卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核仁為標(biāo)記物觀察每張切片.按照上述方法，計(jì)數(shù)每個(gè)標(biāo)本原始卵泡和竇卵泡數(shù).采用單盲法獨(dú)立觀察所有切片.1.2.3卵巢總RNA的提取無(wú)菌狀態(tài)下分離大鼠卵巢組織,液氮冷凍后置于研缽中搗碎勻漿.將樣

5、品組織挑入高壓滅菌的1.5mLEppendof管中,每管加1mLDEPC水,混勻,吸去上清,重復(fù)以上操作.將沖洗后的組織挑出，加液氮，研碎.將研磨好的樣本放入新的1.5mLEppendof管，加入1mLTrizol，混勻，室溫靜置15min.再加入200μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置10min，13000g離心10min.取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEppendof管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置10min，13000g離心10min.棄上清，加1mL750mL/L乙醇（用DEPC水配置）洗滌沉淀，

6、8500g離心5min，吸去上清.空氣干燥沉淀，加40μLDEPC水溶解RNA.-20℃冰箱保存?zhèn)溆?1.2.4引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)大鼠FSHR熒光定量PCR引物.上游引物：5′GTCCTCATCAAGCGACACCA3′；下游引物:5′GGAGGCAGAAATGGCAAAGA3′.片斷全長(zhǎng)103bp.大鼠GADPH內(nèi)參照熒光定量上游引物：5′CTCCCATTCCTCCACCTTTG3′；下游引物:5′CTCCCATTCCTCCACCTTTG3′.片斷全長(zhǎng)110bp.引物均由Invitroge

7、n公司合成.1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)FSHRmRNA取4μLRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer4μL;上游引物(10pmol/μL)0.4μL;下游引物(10pmol/μL)0.4μL;dNTPs（10mmol/μL）0.2μL;MMLV（200U/μL）1μL;DEPC水9μL;RNA模板5μL;總體積20μL.逆轉(zhuǎn)錄buffer成分：50mmolTrisHCl(pH8.0),50mmolKCl,4mmolMgCl2,10mmolDTT.反應(yīng)條件：37℃1h，然后95

8、℃3min.熒光定量PCR反應(yīng)，樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：5×定量PCRbuffer（美國(guó)ABI公司）10μL；上游引物F（10pmol/μL）1μL；下游引物R（10pmol/μL）1μL；SYBRGreenI1μL；dNTPs（10mmol）（Sigma公司）1μL；Taq酶1μL；cDNA5μL；ddH2O30μL；總體積50μL.PCRbuffer成分：10mmolTrisHCl(pH8.0),50mmolKCl,2mmolMgCl2.反應(yīng)條件為