t細(xì)胞受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)用的研究進(jìn)展

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1、T細(xì)胞受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)用的研究進(jìn)展作者：牟艷芳張文峰邵紅偉黃樹(shù)林【關(guān)鍵詞】T細(xì)胞受體免疫治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)特異性抗原的過(guò)繼性免疫治療對(duì)于包括腫瘤在內(nèi)的很多疾病是一種很有潛力的治療方法。T細(xì)胞識(shí)別抗原的特異性主要由T細(xì)胞受體（TCR）決定的，TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)為腫瘤的過(guò)繼免疫治療提供了新途徑。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)某些疾病相關(guān)抗原反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的TCR基因，使人外周血淋巴細(xì)胞具有針對(duì)其相關(guān)抗原的靶向性，在疾病治療方面取得了一定的成效?！　　　細(xì)胞受體（TCR）是T細(xì)胞表面能夠識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)抗原的特異性受體。當(dāng)機(jī)體受到腫瘤抗原刺激時(shí)，由TCR對(duì)APC呈遞的靶細(xì)胞表面抗原肽MHC復(fù)合

2、物進(jìn)行認(rèn)知來(lái)識(shí)別抗原。由抗原識(shí)別所引發(fā)的細(xì)胞毒作用或?qū)?xì)胞殺傷效應(yīng)主要是由CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，而T細(xì)胞表面的TCR和CD3分子組成的TCR復(fù)合物與腫瘤細(xì)胞的MHC抗原肽結(jié)合，為T(mén)細(xì)胞活化提供了第一信號(hào)?！　　　鹘y(tǒng)用于過(guò)繼性免疫治療的腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞主要來(lái)自于TIL或病人PBMC中分離的CTL單克隆，但是在體外培養(yǎng)T細(xì)胞單克隆是非常費(fèi)力的工作，而且常不能達(dá)到所需要的治療量［1］。近年來(lái)，由于相繼分離出腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤抗原特異性TCR基因［2］，這使通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR基因產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞成為可能，也為得到有治療價(jià)值的T細(xì)胞提供了有利的手段?！　?TCR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、技術(shù)　　1．1病毒載體系統(tǒng)　　　　利用病毒載體將TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至T淋巴細(xì)胞，可以得到較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，目前主要采用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。目前在TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中最常用的是以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體?！　　　∧孓D(zhuǎn)錄病毒載體是第一個(gè)被允許用于臨床的載體［3］,也是廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究和臨床試驗(yàn)的載體。目前較常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為Moloney小鼠白血病病毒改建的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這種基因載體宿主細(xì)胞廣泛,能高效地感染分裂期細(xì)胞且能整合到基因組中獲得穩(wěn)定而長(zhǎng)期的表達(dá)。理論上它能轉(zhuǎn)染幾乎100%的靶細(xì)胞,但實(shí)際的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于此［4］。　　　　近年來(lái)很多研究人員通

4、過(guò)改良已經(jīng)提高了其轉(zhuǎn)染效率。如Scholten［5］等密碼修飾通過(guò)改變?nèi)薚CR的α，β鏈恒定區(qū)基因，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LZRS轉(zhuǎn)進(jìn)CD8+T細(xì)胞。通過(guò)基因修飾的TCR的α，β基因與野生型的TCR的α，β基因在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)比較，發(fā)現(xiàn)前者比后者的膜表達(dá)水平顯著提高。此外在4個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)染的TCR基因可穩(wěn)定的表達(dá)且保持較高的活性。Engels等［6］利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將TCRαβ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人初始T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在相同的病毒滴度下，以MPSV為基礎(chǔ)載體比以MLV為基礎(chǔ)的載體有高轉(zhuǎn)染效率和高TCR表達(dá)。此外一些構(gòu)建的其他載體例如pCMMPIRESGFP,當(dāng)TCR基因嵌合體插入載體中，

5、與傳統(tǒng)的載體相比，病毒滴度由6.43×109VP/L上升到2.15×1011VP/L,轉(zhuǎn)染效率由5%～10%上升到50%～60%［7］。但逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞，容納外源基因的DNA片段長(zhǎng)度不超過(guò)8kb，病毒滴度低，不能純化，而且整合過(guò)程中可能引起插入突變，從而引起癌變?！　　　∠俨《据d體是一種線性雙鏈DNA無(wú)包膜病毒。其有廣宿主性，可感染分裂和非分裂終末細(xì)胞。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，外源基因的容納量大，最高可達(dá)36kb，純化和濃縮,滴度高，其DNA不能整合于靶細(xì)胞DNA中，潛在的致癌危險(xiǎn)小?！　　　raciak和Pedersen等通過(guò)重組腺病毒載體短暫表達(dá)TCRVβ8.2基

6、因用于治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［8］。腺病毒基因組不能整合到宿主細(xì)胞基因組上,不能持續(xù)表達(dá),外源基因易隨著細(xì)胞分裂或死亡而消失,表達(dá)時(shí)間短暫,治療中需反復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)。除此以外,容易引起機(jī)體的毒性反應(yīng)和致死性的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞溶解?！　　　÷《据d體克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一些缺陷，近年來(lái)成為新的研究熱點(diǎn)。慢病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒之一,包括人艾滋病毒、猴艾滋病毒、羊Visna/Maedi病毒等7個(gè)亞屬。其中最令人關(guān)注的是以HIVⅠ為基礎(chǔ)構(gòu)建的。慢病毒載體既可以轉(zhuǎn)染處于有絲分裂活躍期的細(xì)胞,又可以轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)免疫反應(yīng)等

7、優(yōu)點(diǎn)。　　　　Joseph［9］等利用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)TCRαβ基因至JurKat/MA細(xì)胞系，通過(guò)用啟動(dòng)子hPGK或SFFV調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高達(dá)85%。Tsuji等通過(guò)慢病毒載體將識(shí)別Cs，轉(zhuǎn)導(dǎo)后CD4+和CD8+T細(xì)胞中β基因表達(dá)明顯增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯較高［10］。但慢病毒用作基因治療載體仍有一定的缺陷，如毒力恢復(fù)、垂直感染等安全問(wèn)題?！　?．2理化轉(zhuǎn)染技術(shù)　　　　基于對(duì)應(yīng)用病毒載體的生物安全性考慮,目前正試圖找到某些基因治療的替代途徑,如通過(guò)理化轉(zhuǎn)染技術(shù)，其對(duì)目的基