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1、哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法探討論文盧虹蓓，張維溪，李昌崇【摘要】目的：探討哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，了解其生長(zhǎng)特性。方法：制作慢性哮喘大鼠模型，用酶解離法、組織貼塊法分別培養(yǎng)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察其生長(zhǎng)情況，用免疫組化SP法分析SMα-action抗原的表達(dá)。結(jié)果：以酶解離法培養(yǎng)2～3d可見細(xì)胞貼壁，7～9d可融合；以貼塊法培養(yǎng)7～10d組織塊周圍有細(xì)胞長(zhǎng)出.freeloothmusclecells，ASMC)培養(yǎng)是研究哮喘發(fā)病機(jī)制的重要手段。ASMC培養(yǎng)常用的培養(yǎng)方法有貼塊法和酶解離
2、法3-4。本研究用以上兩種方法培養(yǎng)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)特點(diǎn)，并進(jìn)行比較。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑4～6周齡雄性SD大鼠，購(gòu)自上海動(dòng)物中心。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液、特級(jí)胎牛血清購(gòu)自法國(guó)BioL內(nèi)含OVA1mg和Al(OH)3100mg；激發(fā)階段：第15天開始以1%OVA生理鹽水溶液霧化吸入，隔天一次，每次30min，共60d。1.3細(xì)胞培養(yǎng)1.3.1ASMC原代培養(yǎng)：組織提取步驟為：以10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射處死大鼠，以75%酒精消毒表皮
3、，從腹部至頸部依次剪開皮膚、肌肉，腹主動(dòng)脈放血后剪開胸腔，自頸部至下迅速分離氣管及肺部組織，剪去心臟，置入含100U/mL青鏈霉素的4℃D-Hanks液中，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，依次去除肺組織、支氣管動(dòng)靜脈、脂肪和殘存結(jié)締組織，僅剩余氣管、支氣管?？v向剖開氣管、支氣管，用外科刀片小心刮除外膜及內(nèi)膜至組織呈透明狀態(tài)，用眼科虹膜剪將氣管段剪成1mm或更小的組織塊。組織貼塊法：將剪好組織塊用牙科探針貼于50mL培養(yǎng)瓶底面（或者直接種于直徑6cm培養(yǎng)皿），等距排列，間隔0.5～1mm，將培養(yǎng)瓶倒置，加入含20%胎牛血清的DMEM(高
4、糖)培養(yǎng)基2mL，不使培養(yǎng)液接觸組織塊。蓋緊瓶口后靜置約使組織塊接近干涸（約3h），輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛好沒過組織塊表面，擰松瓶口靜置培養(yǎng)3d后將培養(yǎng)液添至5mL，第6天全換液，此后每3天換液一次。酶解離法（膠原酶-胰酶混合消化法）：將剪好組織塊裝入15mL離心管中，加入配制好的I型膠原酶溶液2mL（用D-Hanks液配制成含I型膠原酶2mg/mL、木瓜蛋白酶2.5mg/mL、牛血清白蛋白2.5mg/mL的溶液），玻璃滴管輕輕吹打混勻，置入37℃，5%CO2孵箱中消化25min，取出后用含胎牛血清的DMEM(
5、高糖)培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄去上清液，再加0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液2mL，以同樣方法消化15min，離心去上清，加入20%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基約1.5mL，半開放式培養(yǎng)，3d后換液。1.3.2ASMC傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，組織塊外緣細(xì)胞逐漸匯合達(dá)80%以上，即可進(jìn)行首次傳代：倒掉培養(yǎng)液，用4℃D-Hanks液清洗細(xì)胞2～3遍，棄盡清洗液，加入0.25%胰酶溶液2mL，孵箱內(nèi)靜置。約5min后，鏡下觀察大部分貼壁細(xì)胞已脫離瓶底，邊緣透亮，胞質(zhì)回縮，輕
6、晃瓶身可使剩余貼壁細(xì)胞掉落。加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，形成的細(xì)胞懸液以1～10×106/mL接種，每3天換液1次。根據(jù)作者經(jīng)驗(yàn)，1瓶生長(zhǎng)良好原代細(xì)胞每次可以傳代約4～5瓶。1.3.3ASMC的純化：在組織取材過程中注意結(jié)締組織的剝離去除，在保留平滑肌的前提下盡量干凈地刮除內(nèi)外膜。在培養(yǎng)過程中利用平滑肌細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著傳代的次數(shù)增加，平滑肌純度會(huì)逐漸增高。膠原酶-胰酶混合消化法盡量去除了雜細(xì)胞，如上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，故培養(yǎng)出的細(xì)胞純度很高，無需再人工純化。用貼塊法培養(yǎng)出的
7、細(xì)胞，含有較多上皮及成纖維細(xì)胞。1.3.4ASMC鑒定：氣道平滑肌α-actin免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白躉噶酉低?染色呈陽(yáng)性，證實(shí)為ASMC。具體操作：取2～5代ASMC，傳代接種至預(yù)先放置于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，待生長(zhǎng)至致密單層后，作α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色：①多聚甲醛固定20min；②蒸餾水洗玻片3min×3次；③0.6%H2O2洗30min；④0.01mol/LPBS液洗2min×3次；⑤滴加正常山羊血清，室溫20min，不洗；⑥滴加小鼠抗大鼠SMα-actin單克隆抗體(一抗，需完全覆
8、蓋蓋玻片），37℃孵育1h；⑦0.01mol/LPBS液洗2min×3次；⑧滴加小鼠生物素化二抗（需完全覆蓋蓋玻片），孵育10min；⑨0.01mol/LPBS液洗2min×3次；⑩滴加HRP標(biāo)記鏈親和素，孵育10min；0.01mol/LPBS液洗2min×3次；滴加DAB顯色劑，室溫顯色2～5min；自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精透明；鏡檢。2結(jié)果
