jak激酶抑制劑ag490聯(lián)合順鉑對(duì)喉癌細(xì)胞stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用論文

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1、JAK激酶抑制劑AG490聯(lián)合順鉑對(duì)喉癌細(xì)胞STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用論文王俊閣李曉明路秀英【摘要】目的:探討Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在藥物治療喉癌中的作用機(jī)制.方法：應(yīng)用JAK激酶抑制劑AG490與順鉑(DDP)處理喉癌細(xì)胞系Hep2細(xì)胞，TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡.結(jié)果:AG490與DDP可以抑制喉癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡（P=0.008），聯(lián)合應(yīng)用AG490與DDP可以起協(xié)同作用，喉癌細(xì)胞Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員表達(dá)與活性明顯下降.結(jié)論:JAK激酶抑制劑AG490與DDP聯(lián)合應(yīng)用可能為治療喉癌提供了

2、新的理論基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】喉癌增殖凋亡0引言細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一JAK酪氨酸蛋白激酶(Januskinase,JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(signaltransducersandactivatorsoftranscription,Stat)途徑是近來(lái)研究的熱點(diǎn).為了研究Jak/Stat3的活化與喉癌之間的關(guān)系，我們應(yīng)用JAK激酶抑制劑AG490與順鉑（diamminedichloroplatinum.freelL/L小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibcobrl公司)中，于37℃,50mL/LC

3、O2飽和濕度條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期.JAK激酶抑制劑AG490(美國(guó)Calbiochem公司),DDP,RPMI1640液配制藥物溶液,根據(jù)量效曲線選定藥物濃度.1.2方法研究分組：①對(duì)照組；②AG490組；③AG490+DDP組；④DDP組.溶液中含等量乙醇和DMSO.1.2.1AG490對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的檢測(cè)接種細(xì)胞于96孔板，每孔接種100μL含1×104個(gè)細(xì)胞,貼壁后,無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24h，使細(xì)胞同步化.空白對(duì)照組加無(wú)血清培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入AG490至終濃度為30mg/L，DDP的終濃度4mg/L,AG4

4、90+DDP組加藥順序?yàn)橄燃覣G490，于6h后加DDP，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔.分別培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，每孔含150μL培養(yǎng)液，0,24,48,.freela公司），繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入5g/L甲臜200μL，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定A570nm，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,繪制生長(zhǎng)曲線.1.2.2AG490處理后Hep2細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡率無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24h，使同步化，試驗(yàn)組分別加入AG490,至終濃度為30mg/L，DDP的終濃度為4mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)，0,24,48,72h分別消化細(xì)胞，0.01mol/L

5、PBS0.5mL重懸細(xì)胞，冰乙醇固定細(xì)胞過(guò)夜,加入RNAaseA至終濃度50mg/L，37℃恒溫水浴1h，加入碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）（美國(guó)Sigma公司）至質(zhì)量濃度50mg/L，4℃避光染色1h，流式細(xì)胞儀EpicsXLⅡ型（美國(guó)BectonCoulter公司）檢測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，資料用MulticycleAV細(xì)胞周期分析軟件處理.同步化處理及單細(xì)胞懸液制備同前，應(yīng)用凋亡檢測(cè)試劑盒，0.01mol/LPBS離心洗滌2次，200μL結(jié)合緩沖液重懸，加入溴乙啶至終濃度1mg/L，加入PI至2.5mg/L，室溫避光染色15

6、min，流式細(xì)胞儀檢測(cè).1.2.3Stat3蛋白及其靶基因產(chǎn)物表達(dá)和磷酸化活化的檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24h，使細(xì)胞同步化.空白對(duì)照組加無(wú)血清培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入AG490至30mg/L，DDP4mg/L；分別用胰酶消化收集對(duì)照組、AG490組、AG490+DDP組、DDP組.參照美國(guó)Pierce公司蛋白提取方法，分別抽提胞質(zhì)、胞核蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒測(cè)定蛋白濃度.取總蛋白100μg經(jīng)100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，加入Stat3,pStat3,BclxL與CyclinD1小鼠mAb（美國(guó)S

7、antaCruz公司，抗體稀釋度為1∶70），加入二抗體HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（抗體稀釋度為1∶1000），βactin作為內(nèi)參照，用ELC發(fā)光試劑盒（美國(guó)Amersham公司）檢測(cè)雜交信號(hào).用GelPro凝膠分析軟件進(jìn)行半定量分析.用表面密度代表?xiàng)l帶的面積乘熒光強(qiáng)度，來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)含量.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析及兩兩比較法進(jìn)行.2結(jié)果2.1Hep2細(xì)胞增殖活力Stat3在喉癌細(xì)胞系Hep2細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)和磷酸化（圖1）.對(duì)照組沒(méi)有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，AG49

8、0轉(zhuǎn)染后12h開(kāi)始表現(xiàn)出一定的增殖抑制效應(yīng)，36h表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，細(xì)胞活力持續(xù)下降(F=5.26,P=0.004)；DDP組表現(xiàn)出一定的增殖抑制