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1、實(shí)驗(yàn)一酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)（~28學(xué)時）一、目的和要求1．用旋光儀對酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行測定。2．了解掌握蔗糖酶的制備和酶活力的測定。3．學(xué)會米氏常數(shù)的測定。二、實(shí)驗(yàn)原理蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖這個反應(yīng)在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的進(jìn)行。蔗糖及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都有不對稱的碳原子，它們都有旋光性，但是它們的旋光能力不同，所以可以利用體系在反應(yīng)過程中旋光度的變化來描述反應(yīng)進(jìn)程。溶液的旋光度與溶液中所含旋光物質(zhì)的旋光能力、溶劑的性質(zhì)、溶液的濃度、測量樣品管的長度等均有關(guān)系。當(dāng)其他條件不變時，旋光度a與反應(yīng)物濃度C成線形關(guān)系，即a＝kC作為反應(yīng)物的蔗糖是右旋性物質(zhì)，其比旋光度為66.6；
2、生成物的葡萄糖也是右旋性的物質(zhì)，其比旋光度為52.5，但是果糖是左旋性物質(zhì)，其比旋光度為－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈現(xiàn)左旋性質(zhì)。因此，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系的右旋角不斷減小，反應(yīng)到某一時刻，體系的旋光度可恰好等于零，而后就變成左旋，直到蔗糖完全轉(zhuǎn)化，這時體系的左旋角達(dá)到最大值。三、儀器和試劑旋光儀1臺恒溫槽1套葡萄糖、果糖、蔗糖（均為分析純）醋酸－醋酸鈉緩沖溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟1．蔗糖酶的提取取鮮酵母20g于100mL三角瓶中，加入1.6gNaAc，攪拌15～20分鐘后使團(tuán)塊液化，再加3mL甲苯，混和后搖動10分鐘，放在恒溫箱中37℃保溫60小時左右。取出后加
3、入3.2mL4M醋酸和100mL水使pH值在4.5左右。將混合物以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘，離心后形成三層，取中層黃色液體，再以同樣速度離心30分鐘，所得澄清的黃色液體即為蔗糖酶粗品。將此蔗糖酶用pH＝4.6的緩沖溶液稀釋10倍，過濾后冷凍保存。2．作蔗糖轉(zhuǎn)化體系旋光度和濃度的工作曲線根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)化體系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例關(guān)系，可以制作不同濃度下混和體系的旋光度的工作曲線。例如0.1M蔗糖轉(zhuǎn)化體系的旋光度和葡萄糖濃度的工作曲線，實(shí)際上是制作0.1M蔗糖轉(zhuǎn)化進(jìn)程工作曲線，不同的蔗糖濃度有不同的進(jìn)程工作曲線，從若干不同蔗糖濃度的進(jìn)程工作曲線得到這些工作曲線直線關(guān)系很好，且直線的斜
4、率與蔗糖的濃度無關(guān)，經(jīng)過線性擬合，其直線方程為：y＝－60.28x＋a其中x－蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的濃度（M）y－蔗糖轉(zhuǎn)化進(jìn)程中體系的旋光度值a－不同濃度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以測定，也可以通過下式計算。a＝66.6×L×C（L＝10cm，C是蔗糖濃度g/mL）通過上述的直線方程，可以測定任何濃度蔗糖轉(zhuǎn)化體系的旋光度值，求出其轉(zhuǎn)化成葡萄糖的濃度x，從而可以求得不同反應(yīng)時間的葡萄糖濃度。1．酶比活性的測定配制2.5％的蔗糖溶液100mL，測定其旋光度。在20℃的條件下加入蔗糖酶5mL，反應(yīng)3分鐘測定體系旋光度值y，用公式y(tǒng)＝－60.28x＋a求出葡萄糖濃度x，及生成葡萄糖的毫克數(shù)，即可求出酶
5、的比活性。（上述方法制備的酶，其活性約每毫升20單位。）比活性(單位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克數(shù))/(酶的體積)2．蔗糖酶進(jìn)程曲線的制作取200mL0.1M的蔗糖溶液，在35℃水浴條件下恒溫，加10mL蔗糖酶溶液，每5分鐘取出20mL反應(yīng)液加5滴5MNaOH滅活后，測定一次體系的旋光度。求出葡萄糖的濃度，用葡萄糖的濃度對時間作圖，得到蔗糖酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線。時間（分）510152025303540旋光度葡萄糖濃度3．蔗糖酶米氏常數(shù)的測定用緩沖溶液稀釋0.5M的蔗糖溶液成為一系列不同濃度的蔗糖溶液各50mL，在35℃恒溫條件下加入10mL已知活性的蔗糖酶，反應(yīng)5分鐘，加入1mL5MNaO
6、H溶液終止反應(yīng)，測定此時溶液的旋光度，從而求出葡萄糖的生成速度V，根據(jù)米氏方程用反應(yīng)速度V對（V/S）作圖，直線的斜率-Km，直線的截距為Vmax，從而可以求出米氏常數(shù)Km。加入蔗糖體積(mL)蔗糖濃度（M）起始旋光度結(jié)束旋光度葡萄糖濃度（M）反應(yīng)速度V(M/分)V/S11.200.0123.600.0337.200.06410.80.09514.40.12618.00.15721.60.18825.20.21一、數(shù)據(jù)處理1．利用(3)中的數(shù)據(jù)計算酶的比活性。2．利用(4)中的數(shù)據(jù)作酶催化反應(yīng)進(jìn)程曲線。3．利用(5)中的數(shù)據(jù)計算蔗糖酶米氏常數(shù)。六、參考文獻(xiàn)[1]沈同等，“生物化學(xué)”，上冊，
7、人民教育出版社，1980年版。[2]復(fù)旦大學(xué)，“物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)”，上冊，人民教育出版社，1979年版。[3]朱儉等，“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”，上?？萍汲霭嫔?，1981年版。附錄一直線直線方程一般可表示為：y＝a＋bx（1）式中y和x為由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可確定的量；a和b為待定參數(shù)或函數(shù)。例如，對Arrhenius公式指數(shù)式，y和x分別為lnk和1/T；a和b分別為lnA和（－E/k）。對式[lnr=lnk＋nlnC]，y和x分別為lnr和
