有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及bcl2和bax蛋白表達(dá)的影響

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1、有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響【摘要】目的探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響。方法建立衰老大鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和兩組運(yùn)動(dòng)組，運(yùn)動(dòng)組分別給予6次/in，訓(xùn)練12g/kg，青年組腹部注射相同劑量的生理鹽水。連續(xù)注射42d。青年組、自然衰老組和單純模型組（隨機(jī)選取模型組8只）禁食12h后處死，取左心室游離壁全層心肌組織，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，判斷造模是否成功〔3，4〕。1.3造模后分組及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練造模成功后，衰老模型SD大鼠隨機(jī)分為3組，為對(duì)照

2、組，3次/in，水溫31℃～33℃，水深60cm，人工控制大鼠不停地游泳。對(duì)照組放入同樣溫度的淺水中，以避免水溫對(duì)大鼠產(chǎn)生的刺激差異，第1天游泳時(shí)間為30min，以后每天增加10min，直至達(dá)到90min后，保持不變。每次訓(xùn)練結(jié)束后，動(dòng)物能自己抖干身上的水，無疲勞癥狀出現(xiàn)，共訓(xùn)練12ershamBiosciences)。1.4.2標(biāo)本收集末次運(yùn)動(dòng)后48h，斷頸處死大鼠。取左心室前壁全層心肌組織，分為兩份，一份即刻存至-70℃冰箱，用作免疫印跡檢測(cè)；一份用4%多聚甲醛固定24h后蔗糖沉淀過夜，取左心室近心尖處心肌組織作10μm厚

3、冰凍切片，每個(gè)標(biāo)本取兩張不連續(xù)切片，用作TUNEL檢測(cè)。1.4.3TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡新鮮配制3%雙氧水室溫處理標(biāo)本片10min，取TDT和DIGdUTP各1μl加入18μl標(biāo)記緩沖液滴加于切片，37℃標(biāo)記2h；封閉液封閉室溫30min，生物素化抗地高辛抗體37℃反應(yīng)30min；SABC稀釋液反應(yīng)30min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色。每只大鼠觀察兩張切片，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)中的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（apoptosis

4、index，AI）＝凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。1.4.4免疫印跡法檢測(cè)心肌組織中Bax、Bcl2的表達(dá)①蛋白樣品的制備：取凍存的心肌標(biāo)本100mg，加裂解液1ml及PMSF，proteaseinhibitorcocktail，phosphataseinhibitorcocktail各10μl，冰上勻漿30min，4℃12000r/min離心15min,取上清，測(cè)定蛋白濃度后與等體積2×上樣緩沖液混勻后煮沸3min，-20℃保存以備用。②免疫印跡：按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制10%SDSPAGE，以總蛋白量30μg/lane上樣，

5、電泳；轉(zhuǎn)膜，以1∶400鼠抗bax單克隆抗體或1∶400鼠抗Bcl2單克隆抗體及1∶5000辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠IgG孵育，用ECL發(fā)光劑顯示陽性條帶,在Ty2phoon分子成像系統(tǒng)上記錄結(jié)果。以βactin為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白條帶及βactin條帶為同次電泳所得，以兩者的比值進(jìn)行半定量。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1衰老模型制備的結(jié)果TUNEL染色結(jié)果顯示，青年組心肌細(xì)胞AI(4.132±0.308)‰，自然衰老組心肌細(xì)胞AI〔(33.

6、692±2.667)‰〕及單純模型組〔(34.146±2.931)‰〕較青年組明顯增多(P＜0.01)，而自然衰老組與單純模型組無明顯差異。見圖1。2.2各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡和Bcl2、Bax檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，兩組運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞AI均顯著降低（P＜0.01），Bcl2顯著升高（P＜0.01），Bax降低（P＜0.05），Bcl2/Bax顯著升高（P＜0.01）；與6次/yeloidcellleukemia1)、CED9等;二是促細(xì)胞死亡的,主要包括Bax、Bak、BclXS、Bad、Bik、Bid等。其中Bax和

7、Bcl2是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一對(duì)功能基因,Bcl2和Bax蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)：Bax增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl2增高，抑制細(xì)胞凋亡。Bcl2/Bax比值是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素〔6〕。心肌細(xì)胞屬終末分化細(xì)胞,是一種不具備增殖能力的成熟細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡,必然導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少,心臟功能下降,進(jìn)而從生理代償向病理發(fā)展轉(zhuǎn)變，也就是說心肌細(xì)胞過度凋亡加速心臟衰老。有研究證實(shí)運(yùn)動(dòng)可以通過調(diào)節(jié)Bcl2/Bax的比值影響心肌細(xì)胞凋亡。金其貫等〔7〕研究表明過度訓(xùn)練可使Bcl2蛋白表達(dá)下降

8、，心肌細(xì)胞凋亡增加。沈志祥〔8〕等在研究運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠心肌Bcl2、Bax基因mRNA表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Bax、Bcl2基因表達(dá)的影響與負(fù)荷有關(guān),適宜的運(yùn)動(dòng)可以抑制心肌Bax的表達(dá),促進(jìn)心肌Bcl2基因表達(dá),使心肌Bcl2/Bax比值升高。本研究表明經(jīng)過12