用線性動(dòng)力學(xué)方法表征l苯丙氨酸對兔小腸黏膜堿性磷酸酶的抑制作用

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1、用線性動(dòng)力學(xué)方法表征L苯丙氨酸對兔小腸黏膜堿性磷酸酶的抑制作用【摘要】目的：考察用線性動(dòng)力學(xué)方法表征L苯丙氨酸對兔小腸黏膜堿性磷酸酶抑制作用的可靠性.方法：測定堿性磷酸酶水解對硝基苯酚磷酸酯（PNPP）的產(chǎn)物生成初速度.用兩個(gè)底物濃度下標(biāo)定比活性計(jì)算米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm),再據(jù)二者對抑制劑濃度的響應(yīng)確定抑制劑類型和抑制常數(shù).結(jié)果：雙倒數(shù)分析法重復(fù)測定發(fā)現(xiàn)70％的Km和Vm隨抑制劑濃度升高而同步下降，兩動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化對應(yīng)抑制常數(shù)的比值為(2.4±0.6,n=9).線性動(dòng)力學(xué)方法所得參數(shù)精度稍高，Km和Vm隨抑制劑濃度升

2、高同時(shí)下降的出現(xiàn)率約80％，兩抑制常數(shù)之比為(2.0±0.8,n=10)，兩參數(shù)變化對應(yīng)的抑制常數(shù)及兩抑制常數(shù)之比都與雙倒數(shù)分析法一致.如允許兩抑制常數(shù)之比在2.5倍內(nèi)波動(dòng)，則兩種方法都表明L苯丙氨酸為此堿性磷酸酶的反競爭性抑制劑.結(jié)論：此線性動(dòng)力學(xué)方法可用于表征反競爭性抑制劑.【關(guān)鍵詞】L苯丙氨酸；反競爭性抑制；堿性磷酸酶；線性動(dòng)力學(xué)方法；抑制常數(shù)　　0引言　　反競爭性抑制劑用作臨床藥物有明顯優(yōu)勢［1-2］.尋找反競爭性抑制劑需測定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Km和Vm）對抑制劑濃度的響應(yīng)以確定抑制類型及對應(yīng)的抑制常數(shù)Kiv和Kik［2-3］

3、.用雙倒數(shù)分析法測定動(dòng)力學(xué)參數(shù)尋找反競爭性抑制劑時(shí)需用從遠(yuǎn)低于Km到遠(yuǎn)高于Km范圍內(nèi)的底物濃度.常規(guī)定量方法靈敏度有限，在很低底物濃度下測定初速度可靠性差，這限制了用常規(guī)定量方法和雙倒數(shù)分析法篩選反競爭性抑制劑.此前發(fā)現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)方法只用高于Km的兩個(gè)底物濃度也能表征競爭性抑制劑［4-5］.用較高底物濃度有利于用常規(guī)方法定量測定初速度.L苯丙氨酸對大鼠小腸黏膜堿性磷酸酶為反競爭性抑制作用［6］.我們以兔小腸黏膜堿性磷酸酶為模型，考察此線性動(dòng)力學(xué)方法表征L苯丙氨酸對兔小腸黏膜堿性磷酸酶抑制作用的可靠性.　　1材料和方法　　1.1材料

4、　　2amino2methyl1propanol(AMP，美國Fluka公司)；L苯丙氨酸（美國Amresco公司）；對硝基苯酚磷酸酯（美國Sigma公司）；其余為常規(guī)國產(chǎn)試劑.成年大白兔8只，雌雄不拘（本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）.新茂UV7504分光光度計(jì).　　1.2方法　　1.2.1堿性磷酸酶制備　　［7］將8只大白兔小腸黏膜用250mL生理鹽水制成勻漿，1.0mol/LNaOH調(diào)到pH7.5；四層紗布過濾，4℃下1800g離心40min；上清用2.0mol/L醋酸鈉(pH3.8)調(diào)至pH5(出現(xiàn)白色沉淀)，4℃靜置過夜再1800g

5、離心40min；沉淀用150mL生理鹽水溶解，0.5mmol/LNa2CO3調(diào)到pH7.5.再離心、調(diào)到pH5后收集沉淀，用100mL冷蒸餾水溶解，冰水浴中緩慢加入40mL正丁醇，38℃水浴5min，離心收集下層無色水液約100mL，攪拌下緩慢加(NH4)2SO4粉末100g后過夜，離心收集水相和有機(jī)相間黏稠狀不溶物，用pH9.8的AMP溶解，離心去沉淀后-10℃保存.臨用前融化后用pH9.8的AMP緩沖液稀釋.　　1.2.2堿性磷酸酶反應(yīng)　　監(jiān)測緩沖液為100mmol/LAMPHCl（pH9.8），其它試劑均用此緩沖液配制.用13

6、.6(mmol/L)-1·cm-1的消光系數(shù)，據(jù)酶完全作用后的產(chǎn)物量標(biāo)定對硝基苯酚磷酸酯濃度.酶反應(yīng)體系總體積2.0mL，加底物啟動(dòng)反應(yīng)40s后，在2.0min內(nèi)且底物消耗<6％時(shí)段的平均速度為初速度.用0.12mmol/L底物標(biāo)定酶活性，換算成酶活性單位數(shù)(nkat).　　1.2.3抑制類型和抑制常數(shù)確定線性動(dòng)力學(xué)方法　　所用低濃度底物(SL)為0.070mmol/L，高濃度底物(SH)為0.280mmol/L，酶量為適當(dāng)稀釋的堿性磷酸酶液(<1.33μkat/L)30,40,50,60μL.線性回歸得兩底物濃度下每10

7、μL酶液的比活性，用相關(guān)系數(shù)大于0.99的比活性數(shù)據(jù)計(jì)算Km和Vm［4-5］.用雙倒數(shù)分析法時(shí)所用底物濃度為0.018,0.036,0.072,0.108,0.144mmol/L，適當(dāng)稀釋酶液50μL.兩種方法所用苯丙氨酸都小于7.0mmol/L.據(jù)1/Vm和1/Km對抑制劑濃度響應(yīng)的有效性、兩抑制常數(shù)比值確定抑制劑類型和對應(yīng)的抑制常數(shù).　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以回歸分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析.結(jié)果用x±s表示，用SAS8e進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)比較均值，F(xiàn)檢驗(yàn)比較變異系數(shù)，χ2檢驗(yàn)比較Km和Vm各種變化特征的出現(xiàn)率，P<0.

8、05為差異顯著.　　2結(jié)果　　2.1雙倒數(shù)分析法　　表征L苯丙氨酸的抑制作用無抑制劑時(shí)雙倒數(shù)分析得兔小腸黏膜堿性磷酸酶Km為(73±7)μmol/L(n=13)；所用苯丙氨酸濃度下Vm變異系數(shù)小于10％，優(yōu)于測定Km的精