依達拉奉對缺血再灌注損傷后大鼠腦caspase3表達的影響

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1、依達拉奉對缺血再灌注損傷后大鼠腦caspase3表達的影響作者：于亞新劉寶華李海峰劉曉亮【摘要】目的觀察腦神經(jīng)保護劑依達拉奉對創(chuàng)傷性腦缺血再灌注大鼠腦組織的保護作用，并探討其作用機制。方法采用大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型，通過凋亡原位TUNEL檢測評價神經(jīng)細胞凋亡情況，并采用免疫組化的方法檢測各組不同時段大鼠腦組織caspase3的表達。結(jié)果腦缺血再灌注后凋亡細胞在48h達到高峰，治療組和模型組比較在48、72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。caspase3在缺血再灌注12h起顯著增加，

2、48h達高峰期。治療組與模型組比較，再灌注后48、72h可明顯降低caspase3表達(P<0.05)。結(jié)論腦缺血后caspase3表達增高，自由基清除劑依達拉奉可以保護腦組織，其作用可能與抑制caspase3在損傷腦組織中的表達有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】缺血再灌注損傷;caspase3;凋亡;依達拉奉原發(fā)性腦損傷后繼發(fā)的缺血再灌注損傷成為腦損傷不可逆的主要因素。目前依達拉奉(edaravone)是對腦缺血再灌注損傷中產(chǎn)生的自由基進行清除的有效藥物，通過清除自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化抑制腦水腫和遲發(fā)性神

3、經(jīng)細胞死亡，從而有效改善神經(jīng)缺損體征〔1〕。依達拉奉從根本上改變了腦損傷急性期的治療策略和神經(jīng)保護治療措施。本文擬探討依達拉奉對缺血再灌注損傷后大鼠腦caspase3表達的影響?！　?材料與方法　　1.1動物選用健康雄性清潔級SD大鼠160只,體重200～280g,鼠齡3～4個月,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。　　1.2模型制備與分組將入選的動物隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組,其中正常組、假手術(shù)組各5只大鼠,假手術(shù)組給予麻醉及切口暴露。模型組和治療組又分為缺血2h再灌注6、12、24、48、

4、72h組,每小組各5只大鼠。在22℃環(huán)境溫度中實驗，予3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，行頸正中切口，暴露雙側(cè)頸總動脈，麻醉減淺后，右側(cè)上無創(chuàng)微動脈夾夾閉30min，制作大鼠右側(cè)大腦缺血再灌注模型。選用蘇醒后行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為模型成功者進行實驗。　　1.3實驗藥物與給藥方法實驗藥物依達拉奉(必存注射液)由南京先聲藥業(yè)有限公司提供。給藥方法為再灌注同時予尾靜脈注射給藥,之后每隔12h注射給藥1次,直至動物被處死。給藥劑量為0.3mg/100g，濃度為1.5mg/ml?！　?.4取材

5、及標(biāo)本處理在預(yù)定的時間麻醉，開胸，灌注固定，斷頭取腦。在視交叉后1mm及4mm處冠狀切面切開鼠腦，取中間切塊以觀察，進行脫水，石蠟包埋。切片分別進行HE染色，細胞凋亡檢測，caspase3免疫組化染色?！　?.4.1HE染色切片常規(guī)脫蠟，水化蘇木素染色5min鹽酸乙醇分色30s，伊紅復(fù)染1～2min，水洗、脫水、透明、中性樹膠封片。　　1.4.2神經(jīng)細胞凋亡原位TUNEL檢測(1)石蠟包埋切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，l×TBS(20mmol/LTris，pH7.6;140mmol/LNaCl)洗滌。

6、(2)用10mmol/LTrisCl(pH8.0)稀釋蛋白酶K(終濃度為20μg/ml)100μl，覆蓋整個樣本，室溫孵育20min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，l×TBS洗滌。(3)用甲醇1∶10稀釋30%H2O2，每個樣本用10μl30%H2O2與90μl甲醇混合液室溫孵育5min，1×TBS洗滌。(4)加100μl用蒸餾水1∶10稀釋的10×TdT平衡緩沖液(0.5mol/LTris，pH8.0;0.5mol/LNaCl;0.1mol/LMgCl2)，室溫孵育20min，吸去液體，加60μldUTP標(biāo)記反

7、應(yīng)混合液(58.4μldUTP標(biāo)記反應(yīng)混合物;1.6μlTdT酶)，37℃孵育1.5h，l×TBS洗滌，加100μl終止液(0.5mol/LEDTA，pH8.0)，1×TBs沖洗，加100μl封閉液(4%BSA/PBS)，室溫孵育10min，吸去液體。(5)加100μl鏈卵白素(streptavidin)標(biāo)記的過氧化物酶溶液，室溫孵育30min，1×TBS洗滌。(6)加100μlDAB顯色液溶于1ml0.05mol/LTBSpH7.6，室溫孵育10min，蒸餾水漂洗，蘇木素襯染。梯度酒精常規(guī)脫水，二甲苯透明

8、，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。(7)陰性對照片用PBS代替TdT酶，其余步驟相同?！　?.4.3caspase3蛋白檢測(1)組織切片常規(guī)二甲苯脫臘、梯度酒精脫水。(2)蒸餾水新鮮配制3%H2O2，室溫作用10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次。(3)微波修復(fù)抗原:將切片浸入0.1mol/L檸檬酸緩沖液(檸檬酸鈉12.05g，檸檬酸1.891g，加蒸餾水500ml，pH6.0)中，微波爐加熱至沸騰后10m