反義htert體外誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的研究

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1、反義hTERT體外誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的研究作者：尹為華，馬雅，李若馨，孫來保【摘要】目的研究反義hTERT基因體外誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。方法體外通過SuperFect（QIAGEN）轉(zhuǎn)染正、反義hTERT真核表達載體至人肺腺癌細胞株GLC-82，再經(jīng)過G418及PCR篩選鑒定獲得分別轉(zhuǎn)入了正、反義hTERT載體的抗性克隆細胞GLC-82-s和GLC-82-as。然后采用MTT法、雙層軟瓊脂克隆形成實驗、流式細胞術(shù)觀察和分析了反義hTERT對肺癌細胞體外生長增殖活力的影響及是否能誘導(dǎo)瘤細胞的凋亡；同時我們還運用實時熒光定量RT-PC

2、R技術(shù)及TRAP-銀染法對各組細胞內(nèi)源性hTERTmRNA的表達情況及端粒酶的活性進行了檢測。結(jié)果當(dāng)各組細胞傳至第25代后，與GLC-82、GLC-82-s比較，GLC-82-as細胞的生長速度和集落形成能力明顯地減慢和降低，同時伴有凋亡率的顯著增加；與空白對照、正義hTERT組相比，反義hTERT能顯著地降低GLC-82細胞內(nèi)源性hTERTmRNA的表達（P<0.01）和下調(diào)端粒酶活性。結(jié)論反義hTERT體外確實能明顯地誘導(dǎo)肺癌細胞的凋亡及抑制瘤細胞的生長增殖能力?！娟P(guān)鍵詞】反義hTERT；肺癌；凋亡；細胞增殖；實時

3、熒光定量RT-PCR【Abstract】ObjectiveTostudythecellapoptosisoflungcancerinducedbyantisensehTERTinvitro.MethodsThesenseandantisensehTERTeukaryoticexpressionvectorsanufacturer’sinstructions，thentheGLC-82-sandGLC-82-asofG418-resistantcoloniesers.Afterthat，MTTcellularprolifera

4、tionassay，softagarcolonyformationassayandfloetryorcellscanbeinducedtoapoptosisbyantisensehTERT.MeanRNAexpressionandtelomeraseactivitybyquantitativereal-timeRT-PCRandTRAP-silverstainingassayineachgroupcells.ResultsAfter25passagesofthreegroupcells，a7-daycellgrobers(s

5、ize)ofsoftagarcolonyformationshoetry，paredarkablyreducetheendogenoushTERTmRNAexpression(P<0.01)anddoeraseactivityinGLC-82，paredeRT-PCR端粒酶是一種RNA依賴的DNA多聚酶，其主要功能是補充合成端粒DNA；目前已證實端粒酶至少由兩種主要成分構(gòu)成：一種為從頭合成端粒DNA提供模板的人端粒酶RNA（hTR）組份，另一為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白催化亞單位（hTERT），后者才是其活性表達的關(guān)鍵組份和

6、限速因子（rate-limitingfactor）［1］。大量研究表明端粒酶的激活是腫瘤惡性轉(zhuǎn)變的一個早期事件，與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)［2，3］；同樣肺癌及其細胞株也不例外地存在著端粒酶活性的高表達情況［2］，因此封閉和抑制端粒酶使其失活代表著一種惡性腫瘤分子生物治療的一種新的發(fā)展思路，且具有廣譜、高效、低毒的應(yīng)用前景。本研究旨在將靶向端粒酶蛋白亞基的反義hTERT基因真核表達載體轉(zhuǎn)染肺癌細胞GLC-82，觀察其對肺癌細胞體外誘導(dǎo)凋亡及增殖生長的抑制作用，為探索惡性腫瘤治療新途徑奠定實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。1材料與方法1.1材

7、料大腸桿菌DH5α及HeLa宮頸癌細胞株、人肺腺癌細胞株GLC-82為本室凍存，pGEM○R-T載體為Promega公司產(chǎn)品，高效真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(±)為Invitrogen公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI為NEB公司產(chǎn)品。DNALigationKit為TaKaRa產(chǎn)品。Advantage-GC2PCRKit為Clontech公司產(chǎn)品。G418購自上海Sangon，MTT為美國Amresco產(chǎn)品。其余的所需分子生物學(xué)試劑均為Qiagen公司產(chǎn)品。1.2正、反義hTERT基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定參見圖

8、23組細胞第25代之凋亡百分率2.4反義hTERT對肺癌細胞體外增殖生長的抑制作用分別取GLC-82、GLC-82-s及GLC-82-as3組傳至第25代的細胞來繪制7日生長曲線，結(jié)果見圖3。從圖3觀察GLC-82-as細胞增殖速度較GLC-82、GLC-82-s細胞明顯減低，以后4天尤為