多克隆抗體的制備

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1、實(shí)驗(yàn)一多克隆抗體制備微生物與免疫教研室周芳美一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆斩嗫怪苽涞脑砗瓦^程熟悉常用的佐劑掌握福氏完全佐劑的作用機(jī)理和制備方法掌握研磨法和注射器法制備免疫乳劑，掌握制備成功的判別標(biāo)準(zhǔn)掌握動物的免疫方法二、實(shí)驗(yàn)原理抗體：介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原激活后增殖分化為漿細(xì)胞所合成分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體：抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇激活具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞產(chǎn)生的針對這一抗原決定簇的抗體，稱為···天然抗原分子中常含有多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺

2、激機(jī)體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個B細(xì)胞克隆被激活，產(chǎn)生的抗體中含有針對多種不同抗原表位的免疫球蛋白，稱為多克隆抗體。多克隆抗體多克隆抗體制備的意義免疫血清：將抗原注入機(jī)體所產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，含有這種特異性抗體的血清。免疫血清作用：對傳染病的診斷、預(yù)防和治療有重要意義，而且對器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。多克隆抗體優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：作用全面，具有中和抗原，免疫調(diào)理，介導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，ADCC等作用，來源廣泛，制備容易。缺點(diǎn)：特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而應(yīng)用受限。三、實(shí)驗(yàn)試劑與材料動物：健康家兔抗原：生化大實(shí)

3、驗(yàn)中制備的LDL佐劑：弗氏佐劑注射器、研缽等動物的選擇動物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)如要獲得大劑量的抗體，則采用大動物；如要獲得直接標(biāo)記診斷用的抗體，則直接采用本動物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動物制備抗體動物的選擇如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，免疫時應(yīng)同時選用數(shù)只動物進(jìn)行免疫一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔子和羊；抗原就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等.根據(jù)物理性狀可分為顆粒型抗原和可溶性抗原。就抗原性而

4、言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)、物理形狀和彌散速度等本次實(shí)驗(yàn)采用抗原是生科大實(shí)驗(yàn)制備的LDL（至少有2mg，如量不夠則用牛血清白蛋白），用生理鹽水溶解?？乖瓌┝康倪x擇抗原的免疫劑量依照給予抗原的種類，免疫次數(shù)，注射途徑，以及受體動物的種類，免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。劑量過低，不能形成足夠強(qiáng)的免疫刺激劑量過高，有可能造成耐受在一定范圍內(nèi)，抗體效價隨注射抗原的劑量而增高?？乖瓌┝康倪x擇小鼠首次抗原劑量

5、為：50-400μg/次大鼠為100-1000μg/次兔子為200-1000μg/次加強(qiáng)免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5佐劑概念：預(yù)先與抗原同時注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的非特異性免疫增強(qiáng)性物質(zhì)。種類：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。目前應(yīng)用最多的是弗氏佐劑。佐劑佐劑的條件作為一種良好的佐劑，必須具備下列條件：（1）增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性；（2）佐劑與

6、抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，減低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體；（3）佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫功能；（4）良好的佐劑應(yīng)具有無毒性或副作用低的特點(diǎn)。佐劑主要作用機(jī)制：①改變抗原物理性狀，延緩抗原的降解和排除，延長抗原在體內(nèi)滯留的時間②刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其對抗原的處理和提呈能力③刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的能力佐劑主要用途：①增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，用于預(yù)防接種及制備動物免疫血清②作為非特異性免疫增強(qiáng)劑，

7、用于抗腫瘤與抗感染的輔助治療弗氏佐劑動物實(shí)驗(yàn)中最常用的佐劑：①弗氏不完全佐劑(incompleteFreund'sadjuvantIFA)羊毛脂1份+石蠟油5份，混合，高壓滅菌后保存。用時加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進(jìn)行乳化處理。②弗氏完全佐劑(completeFreund'sadjuvant,CFA)弗氏不完全佐劑10ml+卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min滅活處理。四、步驟和方法顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）1、傷害桿菌O抗原的制備：接種37℃18-24h洗下菌苔（用NS）100℃1h

8、過濾4000r/min,20min得到原液稀釋109/ml應(yīng)用液顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）2、免疫方法：選擇體重2-3kg的健康家