骨髓血管內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)及分化鑒定

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1、骨髓血管內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)及分化鑒定作者：宋丹王芳才子斌周慶偉　王桂云蘇冠方【摘要】目的研究分離、培養(yǎng)小鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞的方法并對其進行誘導(dǎo)分化鑒定，為臨床進行缺血性疾病的替代治療奠定細胞學(xué)基礎(chǔ)。方法用灌注法分離小鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞，用血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)其分化，形態(tài)學(xué)觀察細胞的生長過程，并利用抗CD34抗體鑒定血管內(nèi)皮祖細胞，利用抗vethodsTheendothelialprogenitorcellsethodfrombonemarroice，andinducedbyVEGFandbFGF，morphologymethodmunocytochemistrytes

2、t.ResultsThestatusofendothelialprogenitorcellfromBALB/cmicebonemarroorphologicandexpressingtissuespecificprotEin.ConclusionsTheendothelialprogenitorcellcanbeisolatedfromBALB/cmicealgroa公司提供;纖維連接蛋白(FN)由北京鼎國公司提供;抗CD34抗體、抗vEM/F12培養(yǎng)基，從股骨一端進針進行沖洗，反復(fù)3次，充分沖出骨髓組織，用200目不銹鋼篩網(wǎng)進行碾壓，分離成單個細胞。用無血清DMEM/F12離心，棄上清液，

3、2ml無血清培養(yǎng)液重懸細胞加入到淋巴細胞分離液上離心，1500r/min，30min。用吸管吸出中間白色云霧狀細胞帶，培養(yǎng)液洗滌2次。用DMEM/F12培養(yǎng)液(為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，bFGF和VEGF終濃度均為10ng/ml)調(diào)節(jié)細胞終濃度為5×105/ml，接種到預(yù)鋪有纖連蛋白10cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3天換液1次。　　1.3EPCs的誘導(dǎo)分化鑒定〔3〕將培養(yǎng)細胞接種于預(yù)先置有蓋玻片(多聚賴氨酸處理過)的6孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，并加入含bFGF和VEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，于4、20d后分別用丙酮固定，進行免疫細胞化學(xué)染色觀察EPCs的分化。具體步驟如下：

4、3%H2O2水孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育10～15min，傾去，勿洗;滴加1∶100的一抗37℃孵育3h，PBS沖洗(3min×3次);滴加兔抗大鼠二抗，37℃孵育10min，PBS洗(3min×3次);滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10min，PBS沖洗(3min×3次)。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水充分沖洗,脫水,透明,中性樹脂封片并鏡檢?！　?結(jié)果　　2.1骨髓源性EPCs的培養(yǎng)從骨髓分離的細胞接種于培養(yǎng)基后，約2d開始貼壁，呈梭樣或三角形樣增長，4d后細胞生長速度開始增快，約10d開始出現(xiàn)集落樣生長狀態(tài)

5、，有梭形細胞從集落伸出，互相連接成片(圖1)，約18～20d細胞互相融合，呈鋪路石樣狀態(tài)?！　?.2EPCs及ECs的細胞免疫化學(xué)鑒定未加VEGF和bFGF的EPCs免疫化學(xué)染色顯示CD34陽性反應(yīng),培養(yǎng)的部分細胞表面上帶有均勻的棕色顆粒(圖2A)。培養(yǎng)10d經(jīng)VEGF和bFGF誘導(dǎo)后，部分細胞vWF和eNOS染色均呈陽性(圖2B，圖2C)?！　?討論　　當(dāng)前，和老齡化密切相關(guān)的動脈粥樣硬化、腦缺血、心肌缺血、腦梗死和心肌梗死等疾病發(fā)病率日益增高。研究發(fā)現(xiàn)，在這些疾病的恢復(fù)過程中，高齡老化引起機體血管發(fā)育能力障礙，血管生長因子合成減少，血管內(nèi)皮細胞功能異常，對細胞因子的反應(yīng)力也下降。目前已有動

6、物實驗研究移植EPCs治療動脈粥樣硬化和腦梗死，增加內(nèi)皮細胞在這些疾病血液循環(huán)中的動員及增殖，結(jié)果表明內(nèi)皮祖細胞對治療這兩種疾病有著積極的作用〔4～6〕。　　EPCs主要來源于骨髓、外周血、臍血和胚胎，而到目前為止獲取EPCs的研究大多集中在從外周血中提取,骨髓來源的EPCs研究報道為數(shù)不多。因此，本實驗的目的就是從骨髓中分離培養(yǎng)大量EPCs，使其作為種子細胞進行移植用于缺血性疾病的細胞替代治療和基因治療?！　〖毎囵B(yǎng)體系中細胞因子組成成分的不同可影響分離的單個核細胞的生長和分化。本研究中應(yīng)用了細胞因子VEGF和bFGF作為EPCs的誘導(dǎo)分化劑。VEGF是一種可以與肝素結(jié)合的高選擇度的促內(nèi)皮細

7、胞分裂素，可促進內(nèi)皮細胞增生，體外培養(yǎng)中在一定范圍內(nèi)VEGF的濃度和EPSc的生長率呈正相關(guān)〔7〕。bFGF和VEGF有協(xié)同作用，主要促進內(nèi)皮細胞的增殖和移行，使之增生出毛細血管樣的結(jié)構(gòu)，促進新生血管的產(chǎn)生〔8〕。兩者的聯(lián)合應(yīng)用促進了分離的單個核細胞向內(nèi)皮系統(tǒng)的生長和分化，證實了這是一種可行的EPCs培養(yǎng)方法?！　D34抗原是一種表達于細胞表面的糖蛋白，隨著幼稚細胞的分化成熟，其表達水平逐漸下降