甘薯nbslrr類抗病基因同源序列的克隆與分析

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1、摘要甘薯NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆及分析摘要甘薯（Ipomoea.batatas）廣泛分布于世界各地，是重要的糧食作物。威脅甘薯生產(chǎn)的主要病蟲害有莖線蟲病、黑斑病、青枯病和根腐病等，使用常規(guī)育種方法選育甘薯抗病品種存在著育種周期長、效率低等不足，而利用分子生物學(xué)等手段克隆出甘薯抗病基因然后基因工程方法培育抗病品種將是最有效的途徑。目前尚未有克隆得到甘薯的抗病基因的報道。NBS-LRR類抗病基因是R基因中最為普遍的類群，NBS-LRR類蛋白與植物抗病反應(yīng)的發(fā)生有著直接關(guān)系。NBS區(qū)具有結(jié)合ATP或GTP的磷酸的功能，LRR結(jié)構(gòu)域在病原物識別方面發(fā)揮重要作用。本研究依據(jù)NBS

2、-LRR類蛋白的P-LOOP、GLPLA兩個基序設(shè)計引物，對甘薯高抗莖線蟲病品種“AB94078-1”、高感線蟲病品種“徐薯18”及其F1群體進行RGA分離，共獲得26條新的甘薯RGA，已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫并被接受。進行氨基酸序列推導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，獲得的RGA可分為具有TIR和no-TIR兩種結(jié)構(gòu)特征的NBS-LRR類抗病基因同源序列，豐富了甘薯RGA種類和數(shù)量，進一步支持了前人關(guān)于雙子葉植物基因組中存在TIR和no-TIR兩種結(jié)構(gòu)的NBS-LRR類序列的報道，而本研究所獲得的RGA也可作為克隆甘薯抗病基因的候選群體。利用DNAssistversion1.0軟件對26個RGA進行氨

3、基酸序列的推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，R1100-AB、R1100-16、R1100-34、R1100-79、R1100-169等5個序列除具有NBS結(jié)構(gòu)域的4個保守基序外，同時其C端氨基酸序列存在LRR結(jié)構(gòu)，而此前已報道的甘薯RGA均不具有LRR結(jié)構(gòu)域。將本研究獲得的RGA與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的甘薯NBS-LRR類RGA進行聚類分析顯示，來源不同甘薯品種的RGA分屬于不同的類群，新獲得的RGA單獨歸為2大類，為R510類群和R1100類群，說明RGA也可能從另一個方面為植物種群分化提供一定的I甘薯NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆及分析佐證。隨后以R510-AB為探針進行了Southern

4、雜交，結(jié)果顯示分別經(jīng)不同內(nèi)切酶消化的基因組雜交后均出現(xiàn)了多個條帶，表明R510類群在基因組中存在多個拷貝。以克隆的甘薯NBS-LRR類序列上樣作標(biāo)準(zhǔn)對照，與經(jīng)內(nèi)切酶完全消化的基因組DNA同時上樣進行Southern雜交。利用Bandscan軟件掃描對比雜交條帶的強度，采用基因拷貝數(shù)的測定方法及公式經(jīng)計算得出，在甘薯單倍體基因組中R510類群的序列拷貝數(shù)約為17，得到了R510類群在基因組中的具體拷貝數(shù)，初步推測甘薯基因組中存在多拷貝的NBS-LRR類序列。為了進一步證實NBS-LRR類序列甘薯基因組中的多拷貝存在，本研究分別根據(jù)NBS結(jié)構(gòu)域第一模體P-LOOP及LRR結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計寡

5、核苷酸探針，對甘薯基因組中NBS及LRR結(jié)構(gòu)的拷貝數(shù)進行了定量檢測，同時優(yōu)化了利用較小片段的寡核苷酸探針進行Southern雜交的檢測體系，初步得出在甘薯單倍體基因組中具有P-LOOP模體序列的拷貝數(shù)為83，具有LRR結(jié)構(gòu)域的序列的拷貝數(shù)為107。結(jié)果表明，甘薯基因組中存在多個拷貝的NBS及LRR類序列，與已在其他作物中報道的NBS-LRR類RGA在基因組中以多拷貝形式存在的結(jié)果相一致。NBS及LRR結(jié)構(gòu)域在基因組中以多拷貝存在，對抗病基因功能的發(fā)揮及識別多變的抗病位點具有重要意義。甘薯基因組中NBS-LRR類RGA的多重復(fù)存在，一定程度上會增大R基因的進化空間，保證了其能夠產(chǎn)生不同

6、功能的NBS-LRR類R基因，以抵抗不同地域環(huán)境下病原體的侵染。本研究應(yīng)用寡核苷酸探針對未獲得基因組全序列的甘薯基因組進行了Southern雜交，檢測得到了具有NBS及LRR結(jié)構(gòu)域序列的拷貝數(shù)，初步在基因組水平研究了RGA的分布情況，從而為揭示甘薯抗病分子機制及分子育種提供重要參考。此外，我們對獲得的RGA進行多序列比對及同源性檢索顯示，R510-AB、R510-83、R510-34等序列與抗線蟲病基因Mi的序列同源性較高，均達(dá)到了60％，且在某些特征性的區(qū)域幾乎完全一致，提示這些RGA很有可能是抗線蟲病相關(guān)序列，此結(jié)果有助于克隆獲得甘薯抗莖線蟲病基因全長序列，了解其序列中內(nèi)含子及調(diào)

7、控區(qū)等信息，為甘薯抗病育種奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞甘薯；NBS-LRR；抗病基因同源序列；Southern雜交；拷貝數(shù)IIAbstractIsolationandCharacterizationofNBS-LRRtypeResistanceGeneAnalogsfromIpomoeabatatasAbstractSweetPotato(Ipomoea.batatas)wasimportantfoodcropwhichgrownwidelyaroundthewor