實驗六細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定

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1、實驗6細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（Separationofcellnucleiandidentificationofnucleicacids）遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室曹桂群1.掌握離心技術(shù)的原理及離心機的使用；2.熟悉提取分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的方法；3.熟悉鑒定核酸的方法；一、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核１.破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法機械法高速組織搗碎機玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學(xué)法自溶法酶處理表面活性劑處理法利用各細(xì)胞器在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取離心的方法，將細(xì)胞器分離出來。２.離心技術(shù)細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其

2、他微體、核糖體和大分子。離心方法差速沉降離心法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法√√差速沉降離心法(differentialcentrifugation)采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。加速低速高速差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。缺點：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。每種純樣品成份

3、在介質(zhì)溶液中的沉降速度可以表為：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）；d：樣品顆粒的直徑（厘米）；σ：樣品顆粒的密度（克/厘米3）；s：介質(zhì)溶液的密度（克/厘米3）；η：介質(zhì)溶液的粘性系數(shù)（克/厘米·秒）；ω：離心機重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：轉(zhuǎn)/分；r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；密度梯度離心法的理論依據(jù)待分樣品的沉浮行為如何確定？當(dāng)σ>S時V>0即樣品順離心力方向沉降σ

4、這一位置用這個公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或等密度區(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨?。速率區(qū)帶離心法人為地加入不同密度的活性物質(zhì)，形成一個較為平緩的介質(zhì)梯度，將樣品加在介質(zhì)中進行離心，在一定的離心力下根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法用于分離具有一定沉降速度差的顆粒（沉降速度差為20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)。適用于分離密度相似而大小有別的樣品。樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質(zhì)溶液中進行離心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位

5、置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度區(qū)帶離心法。等密度區(qū)帶離心法此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。優(yōu)點：a.分離效果好，可一次獲得較純顆粒。b.適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒。c.顆粒不會擠壓變形。缺點：a.離心時間較長；b.需要制備梯度；操作嚴(yán)格，不易掌握。密度梯度區(qū)帶離心法(densitygradientcentrifugation)1、核酸的種類及其分布請思考？DNA、RNA在細(xì)胞中的分布：DNA胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)(2%)RNA胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)(90%)核酸的種

6、類：DNA、RNA結(jié)論：DNA主要存在于細(xì)胞核，RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)。二、核酸的鑒定2、核酸的水解核酸核苷酸磷酸堿基戊糖定糖法（戊糖的差異）（1）核糖核酸的鑒定濃HCl＋3H2O+β－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羥基甲苯綠色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖（2）脫氧核糖核酸的鑒定DNAＨ＋水解β－D－２－脫氧核糖-H2O硫酸脫氧核糖ω－羥基－γ－酮基戊醛藍(lán)色化合物（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（2）核酸的鑒定0.5g肝組織＋少許石英砂研磨加5ml的1.5%檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾肝勻漿，傾入離心管離心：3000r/m

7、in；10′上層液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖檸檬酸溶液核懸液沿壁緩鋪于8ml0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；5′上層液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀，離心：2000r/min，5′上層液（棄去）沉淀初步純化的細(xì)胞核5ml0.02mol/LNaOH溶解細(xì)胞核待測樣品鑒定實驗流程圖編　號12細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核　液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:編　　號123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羥基甲苯

8、液（滴）3030301.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：（2）核糖核酸的鑒定混合各管沸水浴(10′)冷卻加入5%三氯醋酸(8ml)攪勻后離心2000r/min