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1、華南師范大學(xué)實驗報告學(xué)生姓名羅玉玲學(xué)號20102501014專業(yè)生物科學(xué)年級、班級10科四課程名稱植物生理學(xué)實驗實驗項目植物生理學(xué)第一次實驗實驗類型□驗證□設(shè)計□綜合實驗時間2012年11月8日實驗指導(dǎo)老師葉慶生、冷佳奕實驗評分葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的鑒定1.實驗?zāi)康?.1學(xué)會葉綠體色素提取和分離的方法。1.2了解葉綠體色素的熒光現(xiàn)象、皂化反應(yīng)等理化性質(zhì)。2.實驗原理2.1葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類，這兩類色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮等
2、有機溶劑提取。2.2葉綠素是二羧酸酯，與強堿反應(yīng)形成綠色的可溶性葉綠素鹽，可與有機溶劑中的類胡蘿卜素分開；在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代，形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素；葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。3.實驗器材和試劑3.1實驗儀器與器具研缽、漏斗、剪刀、、圓形濾紙、分光光度計、電子天平、量筒、移液管、滴管、試管、試管架、酒精燈等3.2實驗試劑丙酮、石英砂、碳酸鈣、四氯化碳、無水氯化鈉、乙醚等3.3實驗材料勒杜鵑葉片4.實驗步驟4.1葉綠素提取加入2
3、0mL丙酮少量石英砂、碳酸鈣取2g勒杜鵑葉片去掉主脈，剪碎研磨圓形濾紙過濾收集提取液4.2熒光現(xiàn)象觀察透射光下觀察溶液顏色葉綠素提取液反色光下觀察溶液顏色4.3光對葉綠素的破壞作用色素提取液少許等量分裝于兩試管一支處于黑暗、另一支于太陽光下經(jīng)2h后觀察兩支試管的顏色4.4銅代反應(yīng)滴加一滴稀鹽酸取一支作為對照△少量乙酸銅粉末各取色素提取液2ml于兩支試管中取另一支變褐色后觀察顏色的變化加入20mL乙醚4.5皂化反應(yīng)取色素提取液10mL于分液漏斗搖勻沿漏斗邊緣加入30mL蒸餾水輕輕搖動靜置分層棄去下層丙酮和水蒸餾水沖洗乙醚溶
4、液1次加入5mL30%KOH甲醇溶液加入蒸餾水10mL搖動分液漏斗后靜止10分鐘搖動后靜置將黃色素與綠色素層分裝于2支試管中4.6色素吸收光譜曲線的觀察將皂化反應(yīng)得到的兩管色素液注入比色杯中，另取超純水作空白對照用分光光度計在400~700nm測得色素吸收光譜曲線5.實驗結(jié)果5.1熒光現(xiàn)象觀察色素提取液在鎢絲燈直射下，色素溶液的顏色透射光是為綠色反射光時為紅黑色。這是由于葉綠素分子不吸收綠光，在透射光下為綠色，而葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的紅色熒光，因此反射光下可見紅黑色。5.2光對葉綠素的破壞作用光照處理2h后的提取液暗處理
5、2h后的提取液圖一提取液在黑暗處理、光照后的實驗現(xiàn)象黑暗處色素溶液顏色沒有變化，依然呈現(xiàn)出綠色，如上圖左側(cè)試管中的溶液；經(jīng)太陽光處理后色素溶液顏色變深黑綠色，如上圖右側(cè)試管中的溶液。5.3銅代反應(yīng)加入固體醋酸銅加熱滴加濃HCl圖二銅代反應(yīng)實驗過程中觀察到的現(xiàn)象滴加濃HCl后色素色素提取液的顏色變?yōu)楹稚?，加入固體醋酸銅加熱后，色素溶液顏色變回綠色5.4黃色素與綠色素的分離(皂化反應(yīng))葉綠素層葉黃素層色素層圖三乙醚萃取葉綠素結(jié)果圖四黃色素與綠色素的分裂結(jié)果加入20mL乙醚到分液漏斗萃取色素后，色素溶于乙醚中，置于上層,如圖三
6、所示；加入5mL30%KOH-甲醇溶液后，葉綠素發(fā)生皂化反應(yīng)，最后黃色素溶于乙醚中，置于上層；葉綠素溶于水中，置于下層，如圖四所示。5.5色素吸收光譜曲線的觀察黃色素葉綠素圖五400~700nm測得色素吸收光譜曲線在400~700nm測得兩大類色素的吸收光譜曲線如圖五所示，從圖中可知葉綠素有兩個吸收高峰，分別為420nm左右、640nm；黃色素的吸收高峰則出現(xiàn)在420nm~460nm。6.分析與討論6.1葉綠素可溶于有機溶劑中，可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等提取，本實驗則用了丙酮提取，效果挺好的。6.2
7、葉綠體中的色素所處的環(huán)境具有微堿性，試驗中由于研磨會使細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞液（具有微酸性）流出，酸性的細(xì)胞液就會直接與葉綠體中的色素接觸，致使葉綠素的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，使葉綠素失鎂，呈黃褐色。而碳酸鈣是強堿弱酸鹽，在水中的溶解度很小，但還是有一部分溶解后呈弱堿性，中和細(xì)胞液的酸性，保護了細(xì)胞中的色素。具體是葉綠素分子結(jié)構(gòu)中含有一個鎂原子，當(dāng)細(xì)胞破裂時，細(xì)胞液內(nèi)有機酸中的氫離子可取代美原子而成為褐色的去鎂葉綠素，碳酸鈣中和有機酸的氫離子防止去鎂反應(yīng)的發(fā)生。但如果研磨過程中加入過量的碳酸鈣則會有大量的碳酸鈣不能溶解，影響過
8、濾效果。6.3分配層析的原理是：利用混合物各組分在流動相和固定相兩種不同溶劑中的分配系數(shù)差異，將它們分裂。在紙層析中流動相是指層析相，在毛細(xì)拉力作用下，層析液能不斷由下向上流動。固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具有親水性使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴散而成為固定相。在紙層析過程中，當(dāng)層析液
