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《人早孕胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、人早孕胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)作者：李富軍，王雪萍，劉斌，李焰，李潔【Abstract】AIM：Topreparehighlypurifiedhumantrophoblastcellsfromhumanplacentaeatthefirsttrimesterofnormalpregnancyforfurtherstudyonthefunctionofhumanplacentaevilli.METHODS:AstandardtrypsinDNasedispersionmethodinedbyimmunostainingformarkersoffibroblasts(antivimen
2、tin).Thestructuralfeaturesissionelectronmicroscopy.RESULTS:Thecellviabilityevaluatedbytrypanblueexclusionicroscopicexaminationrevealedthatthecellsentin,indicatingtheabsenceofcontaminatingelements.Transmissionelectronmicroscopyrevealedthatthecellshadfinestructuralfeaturestypicaloftrophoblasts.CO
3、NCLUSION:Themethod,simpleandeasytooperate,canbeusedinstudyingthefunctionofhumanplacentaevilliduringpregnancy. 【Keyega公司，抗角蛋白IgG、抗波型蛋白IgG購自DAKO公司，超敏SP試劑盒購自福州邁新生物工程有限公司，超級(jí)小牛血清購自杭州四季青生物制品研究所，DHank，S液自配，所有液體均高壓消毒或過濾除菌.6~10g/L胰蛋白酶液于37℃振蕩消化20min，若發(fā)現(xiàn)上清黏稠，可再加DNase（150U/L）于37℃繼續(xù)振蕩消化10min，200目篩網(wǎng)過濾.將未消化完
4、全的組織同法消化過濾后與第1次的濾液匯集，1000r/min離心10min，DMEM液洗3遍，加不含血清培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為8×108個(gè)/L，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)1h，鏡下觀察，見細(xì)胞部分貼壁，稍加振蕩也不浮起時(shí)，收集附壁未牢的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，1000r/min離心10min，加含150mL/L超級(jí)小牛血清的培養(yǎng)液，換瓶培養(yǎng).當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞長滿瓶壁的90%左右時(shí)進(jìn)行傳代,在倒置顯微鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)并照相. 122人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)染色，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔培
5、養(yǎng)板中，待細(xì)胞接近長成單層，取出蓋玻片，PBS漂洗，純丙酮固定15min，加過氧化酶阻斷液,37℃,45min,PBS洗滌5min×3次，加非免疫性動(dòng)物血清,37℃,45min,加入1∶75稀釋的一抗,37℃,1h,4℃,24h,PBS洗滌5min×3次，加生物素化二抗，37℃孵育1h，PBS洗滌5min×3次，加鏈親和素過氧化酶溶液,37℃,45min,PBS洗滌5min×3次,加DAB顯色,鏡下觀察,5min左右終止顯色,梯度乙醇脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相. 123透射電鏡觀察選用生長良好細(xì)胞，常規(guī)將細(xì)胞消化，移入Eppendorf管中，1000r/mi
6、n離心10min.加40g/L戊二醛固定4℃過夜.10g/L四氧化鋨后固定2h，50～100mL/L梯度乙醇脫水，樹脂浸透及包埋，60℃聚合48h.飽和醋酸鈾染色10min，枸櫞酸鉛染色10min，透射電鏡觀察. 2結(jié)果 21細(xì)胞形態(tài)學(xué)倒置顯微鏡下可見均勻分布的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，核大卵圓形，位于胞質(zhì)近中央，胞漿豐富透明.細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞形態(tài)，呈片狀鋪展生長.臺(tái)盼蘭排斥試驗(yàn)檢測(cè)，細(xì)胞活力良好，存活率超過90%. 22免疫細(xì)胞化學(xué)染色角蛋白染色陽性率超過95%(Fig1)，波型蛋白染色陽性率低于2%（Fig2）,表明培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞純度超過95%，可以滿足后
7、續(xù)試驗(yàn)的需要. 23透射電鏡觀察透射電鏡下可見細(xì)胞外有大量微絨毛，偶見包被陷窩，胞質(zhì)中線粒體大而多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與糖原顆粒清晰可辯，還可見到電子密度高的脂滴（Fig3）. 3討論 胎盤絨毛組織中含有多種細(xì)胞成分，包括滋養(yǎng)層細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、Hofbauer細(xì)胞及血細(xì)胞等.如何排除間質(zhì)細(xì)胞等其它細(xì)胞成分而保留所需成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵.不同的分離方法所獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞純度從40%至90%不等.角蛋白是構(gòu)成上皮細(xì)胞骨架蛋白，波型蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞及
