基因表達(dá)差異分析方法進(jìn)展

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1、基因表達(dá)差異分析方法進(jìn)展關(guān)鍵詞：基因表達(dá)差異高等真核生物的基因組一般具有80000～100000個(gè)基因，而每一個(gè)細(xì)胞大約只表達(dá)其中的15%［1］。基因在不同細(xì)胞間及不同生長(zhǎng)階段的選擇性表達(dá)決定了生命活動(dòng)的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)控等。比較細(xì)胞間基因表達(dá)的差異為我們揭示生命活動(dòng)的規(guī)律提供了依據(jù)。由于真核細(xì)胞mRNA3′端一般含有poly（a）尾，因此現(xiàn)有的方法基本上都是利用共同引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為對(duì)象研究基因表達(dá)的差異。1992年Liang等［2］建立了一種差異顯示反轉(zhuǎn)錄pCR法（different

2、ialdisplayreversetranscriptionPCR，dDRT-PCR），為檢測(cè)成批基因表達(dá)的差異開(kāi)辟了新天地。迄今為止已出現(xiàn)了大量應(yīng)用該技術(shù)的研究報(bào)道［3，4］。然而，盡管應(yīng)用dDRT-PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)［5］；(2)假陽(yáng)性率可以高達(dá)90%［6］；(3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。近年來(lái)，針對(duì)dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測(cè)差異表達(dá)基因的方法出現(xiàn)，現(xiàn)僅就這方面的進(jìn)展做一簡(jiǎn)要介紹。1.基因表達(dá)指紋（ge

3、neexpressionfingerprinting，gEF）：gEF技術(shù)使用生物素標(biāo)記的引物bio-T13合成cDNA第一鏈，用dGTP對(duì)其進(jìn)行末端加尾，再以富含c的引物引發(fā)合成cDNA第二鏈。用限制性?xún)?nèi)切酶消化雙鏈cDNA，以交聯(lián)有抗生物素蛋白的微球捕獲cDNA3′端，以t4DNA連接酶連接同前述內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的適配子，并以bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進(jìn)行特異的pCR擴(kuò)增，得到大量的特異cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標(biāo)記后，固定于微球上的cDNA片段經(jīng)過(guò)一系列酶切，產(chǎn)生的酶切片段從微球表面釋放出來(lái)，其中那些含有標(biāo)記末端的片段經(jīng)凝膠

4、電泳后構(gòu)成mRNA指紋圖譜。通過(guò)分析不同細(xì)胞間的指紋圖譜就能得到差異表達(dá)的序列［7］。gEF技術(shù)所需的工作量較dDRT-PCR明顯減少，由于用酶切反應(yīng)替代了條件不嚴(yán)格的pCR反應(yīng)，其重復(fù)性也較好，假陽(yáng)性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。gEF技術(shù)最大的缺點(diǎn)在于電泳技術(shù)的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經(jīng)過(guò)幾輪酶切之后常會(huì)得到1000～2000條電泳帶，而現(xiàn)有的pAGE電泳很少能分辨超過(guò)400條帶，故只有15%～30%的mRNA能夠被辨認(rèn)出來(lái)，因此得到的只能是高表達(dá)基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡(jiǎn)單有效的方法；如果希望得到

5、有關(guān)某種細(xì)胞的基因表達(dá)譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術(shù)可能會(huì)有所幫助［8］。2．基因表達(dá)系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression，sAGE）：sAGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來(lái)自某個(gè)轉(zhuǎn)錄子確定位置的核苷酸，其長(zhǎng)度只要有9～10個(gè)bp，就能夠特異地確認(rèn)該轉(zhuǎn)錄子。第二，對(duì)短片段標(biāo)簽的鏈接有利于在同一克隆中對(duì)多個(gè)標(biāo)簽測(cè)序。sAGE也是用生物素標(biāo)記的bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進(jìn)行酶切，捕獲cDNA3′端。在此處產(chǎn)物被分為兩部分，分別與包含有iIS型內(nèi)切酶（標(biāo)簽酶）位點(diǎn)的a、b連接子

6、相接。iIS型內(nèi)切酶的特點(diǎn)是作用位點(diǎn)處于識(shí)別位點(diǎn)之外。這樣經(jīng)過(guò)酶切，就有可能得到只有9～10bp的標(biāo)簽序列。每?jī)蓚€(gè)標(biāo)簽的鈍端結(jié)合后成為pCR的模板，以基于a、b連接子的引物進(jìn)行pCR反應(yīng)的結(jié)果是得到了大量每條包含兩個(gè)不同來(lái)源標(biāo)簽的序列，接下來(lái)再用錨定酶酶切、連接，就能將多個(gè)不同的標(biāo)簽鏈接在一起（大約為每條包含數(shù)十個(gè)不同來(lái)源的標(biāo)簽），克隆至質(zhì)粒載體中后集中測(cè)序［9，10］。sAGE的最終結(jié)果是通過(guò)計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)得到的，根據(jù)某個(gè)標(biāo)簽出現(xiàn)頻率的高低來(lái)判斷并計(jì)算其所屬基因表達(dá)的豐度。對(duì)于在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到對(duì)應(yīng)序列的標(biāo)簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識(shí)

7、別位點(diǎn)的4bp）對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，以尋找新基因。sAGE可以檢測(cè)不同細(xì)胞間已知基因表達(dá)的具體差異，精確到每個(gè)細(xì)胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達(dá)譜，系統(tǒng)地分析基因表達(dá)的差異。它的缺點(diǎn)在于工作量非常大，有大量的測(cè)序及計(jì)算機(jī)分析任務(wù)；而且，對(duì)于尋找新基因而言，僅用長(zhǎng)度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(kù)是很不嚴(yán)格的，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，往往是假陽(yáng)性結(jié)果居多。3.cDNA3′端限制酶切片段顯示（displayof3′endrestrictionfragmentsofcDNAs）:cDNA3′端rFD利用帶有“踵”結(jié)構(gòu)的錨定oligo(dT)引物合成

8、cDNA第一鏈，以okayama和berg的置換法合