實驗六吖啶橙染色檢測細(xì)胞凋亡

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1、實驗六吖啶橙染色檢測細(xì)胞凋亡實驗?zāi)康呐c要求1、掌握吖啶橙染色檢測細(xì)胞凋亡原理和操作方法2、掌握熒光顯微鏡的原理與操作方法凋亡的起始：細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹與質(zhì)膜融合，染色質(zhì)固縮和降解。凋亡小體形成：細(xì)胞核分裂，與細(xì)胞質(zhì)一起形成芽狀突起，逐漸與細(xì)胞分離。凋亡小體被吞噬：實驗原理凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。吖啶橙染色原理吖啶橙(AcridineOrange)是一種熒光染料，它與雙鏈DNA的結(jié)合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍(lán)光(約502nm)激發(fā)下，細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光(約530nm)，核仁和胞質(zhì)RNA

2、發(fā)桔紅色熒光(＞580nm)。吖啶橙的陽離子也可以結(jié)合在蛋白質(zhì)、多糖和膜上而發(fā)熒光，但細(xì)胞固定阻抑了這種結(jié)合，從而主要顯示DNA、RNA兩種核酸。正常細(xì)胞核因含DNA顯示黃綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)與核仁都顯示橘紅色熒光，細(xì)胞體積較大且鋪展。凋亡細(xì)胞體積明顯縮小，核呈黃綠色，斷裂為多個碎塊狀，無核仁，碎裂的核由膜包裹著凸起于細(xì)胞表面呈黃綠色。熒光顯微鏡熒光顯微鏡的成像原理熒光顯微鏡是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。反射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護罩孔徑光欄（F

3、S）視場光欄（AS）落射熒光顯微鏡各部件特性和作用汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)激發(fā)濾色鏡:波長選擇nmT%BANDPASS落射熒光顯微鏡各部件特性和作用吸收濾色鏡:透過熒光,阻擋雜光分色鏡:反射激發(fā)光,透過熒光＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡標(biāo)本濾色鏡的選擇激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡FITC吸收FITC發(fā)射分色鏡濾色鏡：對一定波長范圍內(nèi)的光線進(jìn)行選擇性吸收或透過的儀器。激發(fā)濾色鏡：UV:340-380nmV:390-460nmB:460-500nmG:500-570nm分色鏡：將入射光的部分波長范圍的光反射，其余部分

4、透過的反射鏡。濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收①取細(xì)胞爬片，PBS液漂洗2次，晾干。②95％乙醇溶液固定5min。③滴加0.01％吖啶橙染液染色5min。④PBS液臨時封固(取1張干凈載玻片，滴1滴PBS液，將染色好的飛片細(xì)胞面朝下放在載玻片液滴處)，⑤選擇紫藍(lán)光激發(fā)濾片，熒光顯微鏡觀察。實驗步驟制備細(xì)胞爬片胰酶消化蓋玻片培養(yǎng)紫外照射10min培養(yǎng)12h細(xì)胞凋亡的檢測：誘導(dǎo)凋亡觀察：用藍(lán)紫光濾光片，可見經(jīng)0.01％的丫啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(亮綠色或暗綠色、橙紅色)反射熒光顯微鏡的構(gòu)造優(yōu)點：由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)

5、。物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時，也可以獲得高分辨率的像。厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合?？梢员苊獠槐匾臒晒馍ネ尸F(xiàn)象。缺點：在用低倍率物鏡時，像比較暗，因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡。濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。激發(fā)熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。BV激發(fā)法是以404nm、4

6、34nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素，對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點往往影響極大。熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點

7、考慮：①從熒光像的反差要求來看，UV激發(fā)暗場聚光器照明最好。②以像的亮度來考慮，BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率最高。③UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強，顯示圖像較明亮，反差??；后者因保留暗場光路的性質(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)采用最適合標(biāo)本要求的照明法進(jìn)行觀察。需要注意，即使像反差最佳的UV激發(fā)暗場聚光