玉米種質(zhì)資源rapd分子標記優(yōu)化體系建立

《玉米種質(zhì)資源rapd分子標記優(yōu)化體系建立》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、玉米種質(zhì)資源RAPD分子標記優(yōu)化體系建立摘要：玉米是我國重要的作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。吉林省玉米生產(chǎn)條件優(yōu)越，推廣面積廣，品種的多樣性豐富，為實現(xiàn)品種的管理高效科學(xué)，本實驗以用玉米為材料進行RAPD的研究。建立并優(yōu)化了高效、穩(wěn)定的玉米RAPD實驗體系，為后續(xù)玉米品種的管理提供了理論基礎(chǔ)和實驗支持。關(guān)鍵詞：玉米；RAPD；體系中圖分類號：S513文獻標識碼：A文章編號：1674-0432(2012)-10-0050-1RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)也稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimer

2、PCR),即隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)，是由Williams和Welsh等發(fā)明的分子標記技術(shù)，是一項基于PCR技術(shù)的分子生物技術(shù)［1，2］。是以基因組DNA為模板，常以一個lOmer隨機的寡核苷酸序列作引物，通過PCR擴增，產(chǎn)生許多不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，以檢測DNA序列的多態(tài)性。它可以在物種遺傳背景沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下，對其進行基因組指紋圖譜進行研究，還可用于檢測體細胞雜種和微生物分型［3］。玉米是最為古老的栽培作物之一，目前為我國栽培作物的第二位。吉林省是我國的玉米大省，玉米種植面積在全國位于前五，每年審定的新品種數(shù)目為全國第一。由于目前玉米為品種檢定手段

3、還不完善，導(dǎo)致品種管理有一定的難度。故本文進行了玉米RAPD分子標記體系的相關(guān)研究。1材料與方法1.1供試材料購買市售玉米主推品種種子。1.2試驗試劑和儀器TaqDNA聚合酶、10XPCRbuffer(含Mg2+)、10堿基隨機引物、dNTPs；瓊脂糖、DNA分子量標準(D2000Maker)等購自上海生工。1.3RAPD方法1.3.1DNA的提取以玉米種子產(chǎn)生的嫩芽為材料，使用植物基因組試劑盒提取。DNA回溶于滅菌水中，-20°C保存?zhèn)溆茫?%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。1.3.2RAPD條件及擴增程序根據(jù)王志剛[4]RAPD反應(yīng)體系文獻，玉米RAPD初始25uL反

4、應(yīng)體系包括：2.5uL10XPCRBuffer、0.2umol?L-1引物、0.5UTaqDNA聚合酶、0.1mmol?L-ldNTPs、20ng模板DNA，用ddH20補齊反應(yīng)體系到25uLoRAPD-PCR擴增程序為：94°C預(yù)變性4min,94°C變性50s,38°C退火40s,72°C延伸90s,35個循環(huán)，72°C后延伸lOmin,4°C保存。1.3.3RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化模板DNA濃度，TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度、dNTP定量對影響RAPD反應(yīng)結(jié)果影響較大須進行優(yōu)化。本試驗將各種影響因素設(shè)置梯度，并進行正交實驗，對各個相關(guān)參數(shù)進行了優(yōu)化，以建立較

5、為完善的反應(yīng)體系和程序。1.3.4RAPD產(chǎn)物檢測取5u1擴增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上進行檢測。凝膠成像分析系統(tǒng)照相保存數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。1.3.5引物的篩選將所選擇的樣品提取的DNA等量的混合，作為篩選引物的DNA為模板。并對購買的100個隨機引物分別進行相同條件的RAPD擴增，初步篩選出若干個多態(tài)性引物。再經(jīng)過二次篩選，選取擴增DNA條帶型清晰、差異性和多態(tài)性好的引物。最后確定出最佳的隨機擴增引物。2結(jié)果2.1基因組DNA提取質(zhì)量的檢測本試驗使用試劑盒提取玉米基因組DNA，以1%的瓊脂糖凝膠上檢測，結(jié)果如圖1所示。1玉米基因組電泳檢測結(jié)果從圖中可以看出，主帶

6、清晰，無拖帶現(xiàn)象，間亮度均一，一般每克材料提取DNA產(chǎn)量在30?40?g之間。說明提取基因組DNA質(zhì)量好，產(chǎn)率高，完全滿足RAH）反應(yīng)體系的要求。2.2引物的篩選通過實驗從100個隨機引物中，篩出22個擴增條帶清晰，多態(tài)性好的引物2為部分實驗結(jié)果2玉米RAH)部分實驗結(jié)果2.3RAPD反應(yīng)體系通過實驗對影響RAPD擴增結(jié)果的因子進行研究篩選，并對其影響因素進行了優(yōu)化，篩選出了最合適玉米的RAPD條件，并利用該體系對所選的材料進行擴增，得到了清晰、多態(tài)性高的譜帶，具有較好的重復(fù)性，說明該體系穩(wěn)定可靠，適合于玉米的研究。參考文獻[1]李明芳，鄭學(xué)勤.荔枝SSR標記的研

7、究.遺傳，2004,26(6)：911-916.[2]洪丹丹，王正加，黃堅欽.山核桃SSR反應(yīng)體系優(yōu)化.西南林學(xué)院學(xué)報，27，1:51-54.[3]代漢萍，雷家軍，鄧明琴.長白山野生草莓資源的調(diào)查與分類研究.園藝學(xué)報，2007，34(1)：63-66.[4]王志剛，張志宏，李賀，等.利用RAPD和SCAR標記鑒定草莓品種.園藝學(xué)報，2007，34(3)：591-596.作者簡介：李樹國(1956-)，男，吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授，研究方向：糧食學(xué)與生物化學(xué)。