hif1α對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制

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1、河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師(或指導(dǎo)小組)的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。研究生簽名：參守導(dǎo)師簽名：聲鋤學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)簽名：礦g年；月歲f日河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或

2、撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名：接寧翩虢蝴礦g年≥月易7日中文摘要F-1Q對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制摘要目的：肝細(xì)胞肝癌(humanhepatocellularcarcinomaHCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，因而探索肝細(xì)胞癌的發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制是臨床研究的一大挑戰(zhàn)。肝癌生長(zhǎng)速度快，造成局部組織嚴(yán)重缺氧，缺氧狀況下中腫瘤仍能不斷增殖，浸潤(rùn)，極易侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這也是肝癌研究的重點(diǎn)及臨床治療的難點(diǎn)，但肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。此過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是缺氧誘導(dǎo)因子．1(hypoxi

3、ainduciblefactor-1HIF—1)。HIF一1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。HIF一1Q在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移起重要作用。本研究通過(guò)應(yīng)用HIF一1Q抑制劑YC一1和HIF．1Q的反義寡核苷酸分別處理SMMC一7721肝癌細(xì)胞，觀察不同藥物濃度對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用和對(duì)SMMC一7721細(xì)胞周期及凋亡率的影響，榆洲bcl一2，bax，survivinmRNA和蛋白表達(dá)量的變化，明確缺氧誘導(dǎo)因子一1對(duì)肝癌細(xì)胞周期和增殖調(diào)亡影響及可能機(jī)制，為明確肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及采取相

4、應(yīng)的治療措施提供理論依據(jù)。方法：肝癌細(xì)胞系SMMC一7721分對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，試驗(yàn)組細(xì)胞分別施加HIF—la抑制中文摘要?jiǎng)℡C一1和HIF一1Q的反義寡核：f1：酸干預(yù)，設(shè)濃度梯度和時(shí)間梯度。MrT方法檢測(cè)不同藥物濃度對(duì)SMMC一7721細(xì)胞的增殖的作用；采用FCM檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同藥物濃度對(duì)SMMC一7721細(xì)胞周期和凋亡率的影響；采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，測(cè)定細(xì)胞bcl一2，bax，survivinmRNA表達(dá)的變化，以D．a(chǎn)ctin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)凝膠掃描儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳條帶的光密度值分析，將bcl一2，

5、bax，survivin與$一actin比值作為bcl一2，bax，survivinm11NA表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)bcl一2，bax，survivin產(chǎn)物相對(duì)定量；以Westernblot方法檢測(cè)SMMC一7721細(xì)胞胞漿bcl一2，bax，survivin蛋白表達(dá)的變化，同樣以13一actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)bcl．2，bax，survivin蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。所有數(shù)據(jù)均以i±S表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(GLM過(guò)程)檢驗(yàn)，P<0．05為有顯著差異。結(jié)果1MTT比色法顯示：1．1YC—l對(duì)SMMC一772l細(xì)胞增殖具有抑制作用。不同濃度Y

6、C一1處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0．05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P

7、度ASODN處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0．05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0．05)。HIF一1a的ASODN處理細(xì)胞不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0．05)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異亦具有顯著性(P<0．05)。隨ASODN處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值顯著下降，即ASODN對(duì)SMMC一7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時(shí)間一劑量依賴效應(yīng)(Fig．3，Table2’)(P<0．05)。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布顯示：2．1不同濃度YC一1