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《il審審35基因轉(zhuǎn)染及其對小鼠免疫功能的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、天津醫(yī)科人學碩+學位論文中文摘要目的：探討IL．35質(zhì)粒載體體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性及其對小鼠免疫功能的影響。方法：(1)鑒定格拉斯哥大學惠贈的IL．35基因表達質(zhì)粒載體(pSecTa92．IL35)。設計目的基因IL．35的上下游引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增目的基因IL．35；雙酶切質(zhì)粒載體，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的核酸片段分子量的大?。?2)IL．35基因表達質(zhì)粒載體和另一種綠熒光蛋白表達載體陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法體外轉(zhuǎn)染人腎上皮細胞系293細胞，倒置熒光顯微鏡觀察293細胞綠熒光表達水平評估細胞轉(zhuǎn)染情況，流式細胞術(FC
2、M)分析細胞的轉(zhuǎn)染效率，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞轉(zhuǎn)染后上清液中IL．35的濃度，分析IL．35基因表達情況；(3)采用鼠尾靜脈流體力學轉(zhuǎn)染技術將IL-35基因表達質(zhì)粒載體和PBS緩沖液分別體內(nèi)轉(zhuǎn)染BALBM小鼠，流式細胞技術檢測轉(zhuǎn)染后小鼠外閣血及脾臟CD4+CD8-T細胞、CD4。CD8+T細胞、CD3。CDl6+NK細胞、CD4+CD25+Treg比例；(4)利用密度梯度離心法分離純化體內(nèi)轉(zhuǎn)染IL．35基因表達質(zhì)粒載體的BALB／c(II．2d)小鼠和C57BL／6(H．2b)d、鼠脾臟單個核細胞，分別以經(jīng)絲裂霉素處理的
3、BALB／c和C57BL／6小鼠脾細胞作為刺激細胞，體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的未經(jīng)絲裂霉素處理的BALB／c小鼠脾細胞作為反應細胞，進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察IL．35對培養(yǎng)體系細胞增殖的影響，以流式細胞技術檢測培養(yǎng)體系CD4℃D8葉r細胞、CD4。CD8+T細胞、CD4+CD25十Treg比例。結果：(1)通過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，目的核酸片段的分子量大小均正確；(2)體外轉(zhuǎn)染后倒置熒光顯微鏡可以觀察到綠熒光蛋白表達，流式細胞術分析293細胞的轉(zhuǎn)染效率在35．30％，ELISA可檢測到IL．35基因表達的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細胞上清液中有IL．35
4、的表達；(3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染IL．35可引起小鼠外周血及脾臟CD4+CD25+Treg比例的上調(diào)，外周血CD4+CD8T細胞、CD3’CDl6+NK細胞比例的下調(diào)；(4)IL．35能上調(diào)同種異體混合淋巴細胞反應體系中的CD4+CD25+Treg水平，下調(diào)CD4+CD8"T細胞比例的水平。導致這些變化的原因可能是被轉(zhuǎn)染的小鼠表達了IL．35，引起了脾臟及外周血中CD4+CD25+Treg比例的上調(diào)，增強天津醫(yī)科人學碩十學位論文了Treg免疫調(diào)節(jié)的作用。結論：IL．35質(zhì)粒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染能濤導小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的增殖和分化，并間接
5、或直接抑制CD4+T細胞的活化水平，抑制NK細胞的增殖和分化，從而對免疫移植耐受的建立產(chǎn)生積極的影響。關鍵詞：IL．35；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；T細胞亞群；流體力學轉(zhuǎn)染Ⅱ天津醫(yī)科人學碩+學位論文AbstractIL一35genetransfectionanditseffectontheimmunefunctionofmiceObjective：ToinvestigatethefeasibilityofIL一35invivogenetransfectionanditseffectontheimmunefunctionofmic
6、e．Methods：(1)TheIL-35expressionplasmidvector(pSecTa92一IL35)fromGlasgowUniversityWascharacterized．Upperstreamprimeranddownstreamprimerweredesignedandsynthesized．TheIL-35genewasamplified、枷tllpolymerasechainreaction(PCR)．Theplasmidwasaslodigestedwithspecificrestrictionenzy
7、mes．TheDNAfragmentsweredeterminedbyagarosegelelectrophoresis．(2)TheIL-35expressionplasmidvectororenhancedgreenfluorescenceprotein(EGFP)expressionvectorweretransfectedinto293cellsbylipofectamine．ThetransfectionefficiencyWasdeterminedbyfluorescencemicroscopeandflowcytomet
8、ry．IL-35expressionwasdetectedbyELISA．(3)InvivogenetransferwasperformedthroughhydrodynamictailveininjectionofIL
