豬血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力測定.doc

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1、豬血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力測定學(xué)校青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院年級專業(yè)生物技術(shù)1001姓名毛嘉寧（18765901704）王穎（18765905095）摘要哺乳類動物血液中存在著大量的生物活性物質(zhì),如超氧化歧化酶(Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,簡稱ＳＯＤ)、凝血酶等。是生物體內(nèi)重要的超氧陰離子自由基清除劑，能催化生物體內(nèi)超氧自由基（O2-）歧化反應(yīng)，對機體細(xì)胞起保護作用，己成為化學(xué)及生物化學(xué)研究領(lǐng)域中熱門的研究課題。ＳＯＤ在臨床上有廣泛用途(延緩人體衰老、防止色素沉著、消除局部炎癥等),特別是治

2、療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥。在實驗中利用血塊采用機械破碎法破膜，采用熱變性和乙醇—氯仿沉淀去除雜蛋白，然后用丙酮沉淀得到粗SOD溶液。關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶分離提取豬血1前言體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)?，F(xiàn)已證實，在生物體內(nèi)，SOD具有抗氧化、解毒等重要作用；在體外，具有抗輻射、抗腫瘤及抗衰老、增強人體免疫等功能，廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)，市場廣闊。豬血是SOD的重要來源，我國豬血資源十分豐富，具有獨特的加工優(yōu)勢。本實驗在加熱法的基礎(chǔ)上用有機溶劑丙酮沉淀超氧化物歧化酶SOD，將SO

3、D從血液中提取出來。2實驗?zāi)康模?.1了解SOD的生理功能2.2了解SOD的制備方法3實驗原理：超氧化物歧化酶(SOD)是一種金屬酶，也是一種蛋白質(zhì)，可在一定濃度的酸、堿、鹽溶液中溶解，又可在一定濃度的有機溶劑中沉淀，可以利用這一特點，將SOD從血液中提取出來。3.1加入檸檬酸三鈉作為抗凝血劑使用，通過離心機離心，從豬血中分離出紅細(xì)胞。3.2利用95%乙醇洗掉DNA，利用氯仿抽提血紅蛋白等雜蛋白，再通過離心作用進行離心分離。43.3利用熱變性原理，在隨溫度的升高和實驗操作時間的延長，酶的活性和雜蛋白的含量均呈下降趨勢，從比活性

4、上講豬血中的SOD在55℃-65℃變性。變性時間為15—26min最適宜，酶純度最高。3.4利丙酮作為有機溶劑除雜，離心去沉淀。3.5在一般情況下，SOD酶活性測定只能應(yīng)用間接活性測定法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出02-，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開始后先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30-45s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長處有強烈光吸收。當(dāng)有SO

5、D存在時，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。4實驗設(shè)備4.1恒溫水浴冰浴器4.2離心機4.3布氏漏斗、抽濾瓶、濾紙4.4燒杯、量筒、玻璃棒5實驗材料及試劑5.1豬血5.23.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檸檬酸三鈉5.30.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉5.495%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇5.5氯仿5.6丙酮5.7pH7.6、2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4

6、緩沖液5.8去離子水、蒸餾水5.9pH8.2、50mmol/LTris-HCla.稱取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g,用雙蒸餾水溶解至80ml左右，用HCl調(diào)節(jié)pH=8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。45.1010mmol/LHCl5.1150mmol/L鄰苯三酚a．稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/LHCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。6實驗操作步驟6.1分離血球取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4000r/min離心20

7、min，收集紅血球。6.2除血紅蛋白紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4000r/min離心20min，重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入1～1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4000r/min離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液。6.3熱變性上清液加熱到65℃，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液。6.4沉淀清液在鹽冰浴中冷卻，

8、然后在-5℃以下的操作溫度下，加入1.5倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，快攪慢加，即有白色沉淀產(chǎn)生，用4000r/min離心20min，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液透析，即得粗SOD溶液。6.5鄰苯三酚自氧化速率的測定取兩支試管按下表加入25