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《pcr引物設(shè)計黃金原則》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在15~30堿基之間。引物長度(primerlength)常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間,Tm值最好接近72℃。GC含量(composition
2、)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。4.引物3′端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增的特異性
3、與效率。5.引物3′端不能選擇A,最好選擇T。引物3′端錯配時,不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當(dāng)末位的堿基為A時,即使在錯配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當(dāng)末位鏈為T時,錯配的引發(fā)效率大大降低,G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間,所以3′端最好選擇T。6.堿基要隨機分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)(Falsepriming)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超
4、過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。引物自身不應(yīng)存在互補序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應(yīng)具有互補性,尤其應(yīng)避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Crossdimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話,應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal
5、/mol)。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對較高,而3′端△G值較低。△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性,△G值越大,則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對較高,而3′端△G值較低(絕對值不超過9)的引物。引物3′端的△G值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。(不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進行分析)9.引物的5′端可以修飾,而3′端不可修飾。引物的5
6、′端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點;標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。引物的延伸是從3′端開始的,不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。10.擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響,選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件(比如RNAstructure)可以預(yù)測估計mR
7、NA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實驗表明,待擴區(qū)域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol時,擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時,用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11.引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計完成以后,應(yīng)對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是,各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物;用作克隆目的的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定,引
8、物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。做RealTime時,用于SYBRGreenI法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求:1)避免重復(fù)堿基,尤其是G.2)Tm=58-60度。3)GC=30-80%.4)3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好,但不能重疊。6)PCR擴增產(chǎn)物長度:引物的產(chǎn)物大小不要太大,一般在80-250bp之間都可;80~150b