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《青島地區(qū)鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、青島地區(qū)鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定摘要：2015年鵝掌柴炭疽病在青島地區(qū)發(fā)病嚴重，發(fā)病率達50%。本研究從青島城陽區(qū)采集鵝掌柴炭疽病病葉，采用組織分離法對病原菌進行分離，結(jié)合形態(tài)學觀察與分子生物學方法對其進行鑒定。結(jié)果表明，引起青島地區(qū)鵝掌柴炭疽病的病原菌是膠抱炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.)。此病原菌引起的鵝掌柴炭疽病在山東省是首次報道。關(guān)鍵詞：鵝掌柴炭疽病菌；膠抱炭疽菌；形態(tài)特征；分子鑒定中圖分類號：S436.8+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2016)06-0092-03鵝掌柴(Scheffleraactinophy
2、lla[Endl.]Harms)俗名大葉傘，隸屬五加科，鵝掌柴屬，是一種深受人們喜愛的常綠觀葉木本花卉植物，可用于花園、花壇、道路綠化或者作為盆栽置于庭院和室內(nèi)觀賞。鵝掌柴原產(chǎn)于大洋洲、我國廣東、福建等亞熱帶雨林，日本、越南、印度也有分布，現(xiàn)廣泛種植于世界各地。但是，鵝掌柴在繁殖和栽培種植時常會發(fā)生病害，大大影響其觀賞價值。對鵝掌柴的病原真菌，美國記載了15種［1］。在我國，2003年，習平根等［2］調(diào)查鑒定了廣東省鵝掌柴12種真菌病害及其病原菌，其中以葉疫病和炭疽病危害較重。2012年，黃江華等⑶對廣東省鵝掌柴炭疽病病原菌進行鑒定。2015年，鵝掌柴炭疽病在青島地區(qū)發(fā)病嚴重，發(fā)病率高達50%
3、。為有效防控鵝掌柴炭疽病，筆者用病原形態(tài)學及分子生物學方法研究青島市鵝掌柴炭疽病病原菌，為該病的綜合治理提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1供試材料2015年11月采集青島城陽地區(qū)的鵝掌柴炭疽病病葉，并對其進行分離純化。1丄2試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸憾水lOOOmL；75%乙醇(化學純)；0.1%升汞溶液；無菌水。1.2試驗方法1.2.1病原菌的分離純化與培養(yǎng)采用組織分離法對鵝掌柴病葉上的病原菌進行分離。于病健交界處切取病組織長度為4?5mm的小塊，置于75%乙醇中浸泡5s，接著移入0.1%升汞溶液中浸泡3?5min,無
4、菌水漂洗3遍，最后將病組織移到PDA培養(yǎng)基上，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7d［4］o從邊緣挑取病原菌菌絲于PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)箱中進行純培養(yǎng),4d后挑取純培養(yǎng)菌絲至斜面保存。1.2.2致病性接種及再分離挑取3片健康鵝掌柴葉片，用無菌水清洗葉片表面并用酒精消毒。用滅菌針將葉片刺傷，再接種病原菌塊，將接好菌的葉片放在盛有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25°C培養(yǎng)7d后觀察發(fā)病情況，以無菌PDA接種作為陰性對照。從接種的發(fā)病組織上再次分離純化病原菌。1.23病原菌形態(tài)觀察用1mL無菌水反復沖洗PDA上的分生抱子以獲得濃度為104個/mL的抱子懸浮液，用滅菌接種針挑取少量菌絲置于滅菌載玻片上,用挑針挑
5、取培養(yǎng)基內(nèi)部的菌核放在滴有無菌水的載玻片上，在OlympusBX53顯微鏡下觀察病原菌的菌核、菌絲、分生鞄子梗和分生鞄子特征并拍攝形態(tài)圖，測量分生抱子大小。1.2.4病原菌rDNA-ITS序列測定采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[5],用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[6](ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-37；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-37)°PCR反應體系為25HL,反應液為：10XBuffer2.5UL,dNTP1uL,引物(ITS1和ITS4)各1?L，Taq酶0.5口L，DNA模板3UL,ddH2016uLoP
6、CR擴增程序：94°C預變性5min；94°C變性45s,53°C退火45s,72°C延伸1min,進行30個循環(huán)；72°C總延伸10mine在質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上檢測PCR結(jié)果,產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并進行BLAST同源性對比。2結(jié)果與分析2.1鵝掌柴炭疽病癥狀發(fā)病初期，病斑從枝干中間向上向下發(fā)展，沿著葉脈侵染葉片，病斑近橢圓形，灰白色，形狀規(guī)則至不規(guī)則形。在環(huán)境陰濕的情況下病斑不斷擴展成水澤□□狀墨綠色病塊，發(fā)病嚴重的植株整條枝干和葉片均成墨綠色，枝干橫切后內(nèi)部也都變成墨綠色至黑褐色。后期病斑上可見黑色小點，為病原菌的分生抱子盤,濕度大時病部可產(chǎn)生大量的粉紅色
7、粘抱團（圖1）。2.2病原菌形態(tài)觀察在PDA培養(yǎng)基上，鵝掌柴炭疽病病原菌菌落白色至灰白色，邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達，后期產(chǎn)生菌核可長至培養(yǎng)基內(nèi)。病原菌分生抱子梗無色，具隔膜；分生抱子無色，單抱，長橢圓形至圓柱形，較直，大小為（13.3?18.4）umX（3.8?5.6）um（圖2）。根據(jù)形態(tài)結(jié)果初步判定病原菌為膠抱炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)o2.3rDNA-
