細(xì)菌生物被膜定性和定量研究方法

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1、細(xì)菌生物被膜定性和定量研究方法　　摘要：細(xì)菌生物被膜是浮游細(xì)菌和生物被膜細(xì)菌共同分布于同一生存空間內(nèi)的特殊生長方式，能夠逃避抗生素和機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除而得以繼續(xù)生存。對細(xì)菌生物被膜定性和定量方法進(jìn)行了綜述，比較和分析了其優(yōu)缺點，旨在評價各種方法在生物被膜研究中的適用性。　　關(guān)鍵詞：細(xì)菌生物被膜；浮游細(xì)菌；定性方法；定量方法　　中圖分類號：Q939.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2016）09-2177-04　　細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌將其自身包裹在其分泌物內(nèi)形成的一種特殊復(fù)合體，具有不同于浮游細(xì)菌的

2、一些特殊性質(zhì)，如生物被膜形成后造成細(xì)菌對外界環(huán)境的抵抗能力增強(qiáng)，在臨床上形成對常用抗菌藥物的耐受性，使得細(xì)菌性感染疾病遷延不愈和持續(xù)反復(fù)發(fā)作，給疾病治療帶來一定的難度。隨著研究方法的發(fā)展和多學(xué)科研究領(lǐng)域的交叉和拓寬，近年來細(xì)菌生物被膜的定量和定性研究方法越來越完善，這些方法根據(jù)原理大致可分為三類：①基于生物被膜胞外基質(zhì)和生物被膜內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)量（包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞）的定量試驗：⑦基于活細(xì)胞的活菌計數(shù)試驗：③7基于生物被膜胞外基質(zhì)成分的定量試驗。在相關(guān)研究中，研究者對生物被膜的結(jié)構(gòu)、活性和細(xì)菌組成動態(tài)變化規(guī)律等

3、方面研究取得了很大的進(jìn)展，尤其是無損傷的、原位的和在線的技術(shù)能夠提供自動的、快速的和實時的信息，為生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比較了幾種常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的優(yōu)缺點，以期評價各方法在生物被膜研究中的適用性?！　?常用生物被膜定性研究方法　　生物被膜定性研究方法主要借助各種染色方法（如銀染法）、光學(xué)和光譜學(xué)方法（如光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)等）進(jìn)行生物被膜檢查和監(jiān)測，尤其是顯微檢查技術(shù)在觀察選取生物被膜細(xì)菌群體的結(jié)構(gòu)參數(shù)和構(gòu)效關(guān)系方面具有明顯的優(yōu)勢。在生物被膜定性研究中，

4、最常用的方法有以下幾種?！　?.1快速銀染法　　快速銀染法主要用于細(xì)菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通過快速銀染法能夠?qū)⒓?xì)菌生物被膜中的多糖蛋白復(fù)合物染成灰褐色或灰黑色，通過銀染能夠初步判斷不同培養(yǎng)階段生物被膜中多糖蛋白復(fù)合物的動態(tài)變化規(guī)律，其操作步驟具體包括10個操作步驟：①基質(zhì)材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸餾水漂洗；④氯化鈣結(jié)合；⑤蒸餾水漂洗；⑥硝酸銀染色；⑦對苯二酚顯色；⑧蒸餾水漂洗：⑨硫代硫酸鈉固定：⑩蒸餾水漂洗?！　?.2玻璃試管法　　其原理是根據(jù)氣-液界面形成染色環(huán)狀物的顏色深淺來判定細(xì)

5、菌生物被膜的形成能力。常用的染料有結(jié)晶紫和剛果紅等，由于該方法存在一定的主觀誤差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步篩選?！　?.3基于電子顯微鏡的定性方法7　　借助原子力顯微鏡、透射掃描電鏡和激光聚焦顯微鏡等對細(xì)菌生物被膜進(jìn)行觀察，能夠?qū)ι锉荒さ牧Ⅲw結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。尤其是相關(guān)染料與激光共聚焦顯微鏡相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對生物被膜中細(xì)菌生理狀態(tài)的定性和定量分析。相關(guān)電子顯微鏡定性研究方法的缺點是實驗條件要求較高，實驗設(shè)備較貴重，因此不常用于常規(guī)檢測和研究。隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，近年來，在實際的科研中。電子顯

6、微鏡相關(guān)技術(shù)常與染色技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌生物被膜的定性和定量研究?！　?生物被膜定量研究方法　　2.1瓊脂平板菌落計數(shù)法　　瓊脂平板計數(shù)法是一種最基本的菌落計數(shù)法，在實際的實驗操作過程中不僅勞動強(qiáng)度大，而且費時，同時誤差較大，不適宜大樣本觀察。雖然可以通過多次計數(shù)求平均值的方法來減小實驗誤差，然而這樣無疑會增大工作量和強(qiáng)度，因此在實際實驗中很少單獨采用，常常結(jié)合其他方法對細(xì)菌生物量進(jìn)行定量研究。在生物被膜細(xì)菌計數(shù)過程中，需要輔助手段將生物被膜中的細(xì)菌游離，輔助手段對被膜細(xì)菌的影響也制約著瓊

7、脂平板菌落計數(shù)法的重復(fù)性?！　?.2結(jié)晶紫（CV）染色法　　結(jié)晶紫是一種堿性染料，能夠結(jié)合生物被膜表面帶負(fù)電荷的表面分子和胞外基質(zhì)中的多糖成分，通過測定吸光度來對細(xì)菌生物被膜形成能力進(jìn)行鑒定和分型。由于生物被膜中的胞外基質(zhì)成分和細(xì)菌本身（包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞）均能被結(jié)晶紫染色，因此改良結(jié)晶紫方法尤其不適合用于對抗菌藥物或者其他化學(xué)物質(zhì)對生物被膜內(nèi)細(xì)菌殺傷效果的評價。在研究中常用來對細(xì)菌生物被膜下次形成能力進(jìn)行初步篩選和鑒定。7　　1985年Christensen等首次采用結(jié)晶紫染色方法對非黏液性鏈球菌生物被膜

8、進(jìn)行了定量分析，2000年，Stepanovic等對結(jié)晶紫方法進(jìn)行改進(jìn)，增加了結(jié)晶紫染色方法對細(xì)菌生物被膜定量的準(zhǔn)確性，其能夠?qū)ξ⒖装迳锉荒ど锪窟M(jìn)行較為全面的量化。然而，結(jié)晶紫染色方法在銅綠假單胞桿菌生物被膜定量中具有較大的批內(nèi)和批間誤差，其原因可能與銅綠假單胞桿菌含有較多的水通道導(dǎo)致其生物被膜固定不充分有關(guān)?！　?.3Syt09/PI染色法　　Syto9是一種能夠?qū)怂徇M(jìn)行染色的熒光染料.能夠