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《利用gateway克隆技術(shù)構(gòu)建丹參smnac1轉(zhuǎn)錄因子rnai表達(dá)載體》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建丹參SmNACl轉(zhuǎn)錄因子RNAi表達(dá)載體［摘要］NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育和對生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建丹參NAC轉(zhuǎn)錄因子的RNAi植物表達(dá)載體，以便進(jìn)一步研究丹參NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能。根據(jù)Gateway技術(shù)要求，設(shè)計含有attB接頭的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通過PCR方法，擴增SmNAC1基因的特異性片段。通過BP重組反應(yīng)，將帶有attB接頭的PCR產(chǎn)物克隆到入門載體pENTR/SD/D-TOPO±,再通過L
2、R重組反應(yīng)，利用入門載體上的SmNACi特異性基因片斷克隆到植物表達(dá)載體pK7GWIWG2D上。實驗結(jié)果表明Gateway載體的構(gòu)建方法能夠高效、快速地將目的基因克隆到表達(dá)載體上，為植物基因轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)。［關(guān)鍵詞］RNAi；Gateway載體；BP和LR反應(yīng)Gateway克隆技術(shù)是由invitrogen公司開發(fā)，基于入噬菌體的位點特異性重組原理［1-2］,可以使DNA片段在不同的克隆載體之間實現(xiàn)轉(zhuǎn)移，并保持基因定位和閱讀框架不發(fā)生改變。入噬菌體的位點特異性重組是在噬菌體和細(xì)菌的整合因子(INF,I
3、nt)的作用下，入噬菌體的attP位點和大腸桿菌基因組的attB位點可以發(fā)生定點重組，入噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生2個新位點:attL,attRo這是一個可逆的過程，在噬菌體編碼蛋白Xis和細(xì)菌的整合因子IHF,Int的共同介導(dǎo)下這兩個新位點可以再次重組回復(fù)為attB,attP位點。這一過程受編碼蛋白Xis和整合因子（IHF,Int）調(diào)控。與經(jīng)典基因克隆多個步驟相比，Gateway技術(shù)不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到
4、表達(dá)載體（destinationvector,目的載體）上，該方法只需一步生化反應(yīng)便能達(dá)到目的，是高通量克隆基因的好方法。Gateway技術(shù)可以在任何選擇的系統(tǒng)：細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物等［3-7］進(jìn)行基因的功能表達(dá)分析?，F(xiàn)在的多點Gateway技術(shù)［8］,能夠?qū)⒁粋€或多個基因克隆到蛋白表達(dá)載體，這項強大的體外重組技術(shù)大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，且同時克隆效率高達(dá)95%或更高。當(dāng)基因在重組目的表達(dá)載體之間快速簡便的穿梭時，還可以保證正確的方向和閱讀框，同時，Gateway也有助于進(jìn)行帶有
5、不同標(biāo)簽蛋白的表達(dá)和純化，見圖loNAC是高等植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，自20世紀(jì)90年代從矮牽牛分離第1個NAC基因后［9］。擬南芥中已發(fā)現(xiàn)109個NAC轉(zhuǎn)錄因子，水稻中有75個NAC［10］oNAC蛋白根據(jù)N端保守序?qū)AC蛋白分為兩大類（I,II）,各包含14和4個亞類[ll]oNAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，如花器官的發(fā)育、側(cè)根的形成、木質(zhì)部次生壁的形成以及葉片衰老等，同時NAC還參與生物脅迫和非生物脅迫。本項工作設(shè)計帶有attB位點(CACC)的引物，利用PCR擴增目的基因SmNA
6、C1片斷，以pENTR/SD/D-TOPO為入門載體，進(jìn)行BP重組反應(yīng)，形成帶有目的基因片斷的入門載體,經(jīng)PCR檢測，測序鑒定正確后，在LRClonase酶作用下，將BP重組反應(yīng)的克隆產(chǎn)物與表達(dá)載體pK7GWIWG2D,進(jìn)行LR重組反應(yīng)，最終得到含目的基因SmNAC1的RNAi植物表達(dá)載體。通過使用Gateway技術(shù)，簡單、快捷、準(zhǔn)確的構(gòu)建成功丹參轉(zhuǎn)錄因子SmNAC1的RNAi表達(dá)載體。1材料丹參Salviam訂tiorrhizaBunge植株；pENTRDirectionalTOPOClonin
7、gKits,GatewayLRClonaseIIEnzymeMix,Gateway載體pK7GWIWG2D均購于Invitrogen公司；大腸桿菌EscherichiacoliDH5a感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Phusion超保真聚合酶購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物公司；ExTaq酶購自大連寶生物工程有限公司；卡那霉素、壯觀霉素購自Amresco公司；所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。2方法2.ISmNACI基因RNAi片段的PCR擴增利用DNAman軟件設(shè)
8、計NAC基因的特異性RNAi片段，根據(jù)Gateway載體構(gòu)建的要求，引物5’末端要加上CACC,NACi-F:CACCATTTTCTCGAATTGAATGATTTGGGCCC；NACi-R：CTGATTTGTGTGTGCCTCGGTTACG□使用Phusion超保真酶PCR擴增反應(yīng)程序：98￡預(yù)變性30s,然后進(jìn)行35個循環(huán)：98°C30s,57°C30s,72°C30s,循環(huán)結(jié)束后72°C10min延伸反應(yīng)，4°C保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。2.2BP重組反應(yīng)將PC
