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《GBT27528-2011-口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11．220B41園宜中華人民共和國國家標準GB／T27528—201口蹄疫病毒實時熒光RT—PCR檢測方法Real—timeRT-PCRfordetectionoffootandmouthdiseasevirus201卜11—21發(fā)布2012—03—01實施宰瞀徽鬻瓣警襻瞥霎發(fā)布中國國家標準化管理委員會“?標準分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費下載前言GB／T27528--201本標準的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。本標準由全國動物防疫標準化技術委員會(SAC／TC181)歸口。本標準起草單
2、位：中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局、中國檢驗檢疫科學研究院、北京盈九思科技發(fā)展有限公司。本標準主要起草人：秦智鋒、林祥梅、吳紹強、花群義、盧體康、劉建、陳書琨、呂建強、曾少靈、詹愛軍、韓雪清、孫潔、曹琛福、賈廣樂、高小博、陳兵、阮周曦、梅琳、張彩虹、陶虹。標準分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費下載口蹄疫病毒實時熒光RT—PCR檢測方法GB／T27528--20111范圍本標準規(guī)定了口蹄疫病毒實時熒光RT—PCR檢測方法。本標準適用于口蹄疫病毒的檢測與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是
3、注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB／T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB／T18088出入境動物檢疫采樣GB／T18935口蹄疫診斷技術GB19489實驗室生物安全通用要求sN／T1193基因檢驗實驗室技術要求3縮略語下列縮略語適用于本標準。ct值：循環(huán)閾值(cyclethreshold)。4試劑耗材和儀器設備4．1試劑耗材4．1．1除非另有說明，在檢測中使用的
4、試劑均為分析純，實驗室用水應符合GB／T6682的要求。4．1．21：3蹄疫病毒實時熒光RT—PCR試劑：一20％保存，見附錄A。4．1．3引物和探針序列上游引物(FMDV—F)序列為：57ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA3‘。下游引物(FMDV—R)序列為：57GCGAGTcCTGCcAcGGA3’。TaqMan探針(FMDV-Pb)序列為：57TCCTTTGCACGCCGTGGGAC37，其5’端和37端分別標記FAM和BHQ。4．1．4DEPC處理水：見附錄B。推薦購買商品化DEPC處理的無DNA酶和RNA酶的水。
5、4．1．5氯仿：分析純，常溫保存。4．1．6異丙醇：分析純，使用前預冷至--20℃。4．1．775％乙醇：用DEPC水和無水乙醇配制，使用前預冷至一20℃。4．1．8石英砂：市售化學純，121Y：，15min高壓滅菌后備用。4．1．90．0lmol／LPBS，pH7．6～7．8：見附錄B。4．1．10陽性對照為滅活疫苗毒或組織培養(yǎng)滅活毒，一20℃保存?zhèn)溆?。陰性對照樣品可采用健康的豬或牛的組織材料。4．2主要儀器設備4．2．1熒光PCR檢測儀。4．2．2高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃，離心速度可達120009以上。1標準分享網(wǎng)www
6、.bzfxw.com免費下載GB／T27528—20114．2．3生物安全柜。5采樣和樣品前處理5．1樣品采集、保存及運輸按照GB／T18088和GB／T18935的要求進行。5．2樣品制備5．2．1樣品的制備應符合GB19489規(guī)定。5．2．2用無菌的手術刀采取動物機體組織(如舌、鼻、蹄水泡皮)o．2g～1．0g置研缽中，加入等量滅菌石英砂充分研磨。其他機體組織(如淋巴結、扁桃體、肌肉等)除去包膜和其他結締組織，選取內部實質部分，置研缽中，加人石英砂充分研磨。然后按照1：5比例加入0．01mol／LPBS(pH7．6～7．8)，4
7、℃浸泡過夜或者--20℃反復凍融2次，每次30min。然后4℃80009離心5min。5．2．3液體樣品如水泡液或者食道咽部黏液(O—P液)不必經(jīng)過研磨或者凍融處理，直接進行下一步。6核酸提取6．1核酸提取要求核酸提取應按照SN／T1193進行。6．2傳統(tǒng)酚氯仿法抽提核酸6．2．1取滅菌的1．5mL離心管，做好標識。6．2．2每管加入600pL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200此，再加入200pL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s，于4℃120009離心15mia。6．2．3取滅菌的1．5mL離心管，加入--20℃預冷40
8、0pL異丙醇，吸取本標準6．2各管中的上清液轉移至相應的管中，避免吸出中間層，顛倒混勻。6．2．4于4℃120009離心15rain，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入600pL75％預冷乙醇，顛倒洗滌。6．2．5于4℃12000
