mscs多向分化潛能及對(duì)失神經(jīng)肌萎縮作用

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1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文MSCs多向分化潛能及對(duì)失神經(jīng)肌萎縮的作用華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院手外科李濤武漢，430022博士研究生：李濤博士生導(dǎo)師：洪光祥教授摘要第一部分MSCs多向分化潛能（成骨、成肌以及神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化）的研究摘要目的①探討間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外誘導(dǎo)分化為骨樣細(xì)胞、肌樣細(xì)胞以及神經(jīng)元（NCs）樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的有效方法。②評(píng)價(jià)體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)前體樣細(xì)胞（NPCs）、神經(jīng)元（NCs）樣細(xì)胞以及星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的體外存活和增殖特性，為神經(jīng)細(xì)胞再生尋找良好的種子來源。方法參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用貼壁篩選法自大鼠骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行

2、傳5~6代純化，收集得到第5代（P5）間充質(zhì)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液(1×10/ml)。①成骨誘導(dǎo)分化方案：DMEM/10%FBS培養(yǎng)基＋0.1μmol/l地塞米松＋50ng/ml維生素C＋2.16mg/mlβ-甘油磷酸鈉。誘導(dǎo)分化2周以上。行VanKossa銀染色和茜素紅染色。②成肌誘導(dǎo)分化方案：DMEM/20%FBS＋3μmol/l5-氮胞苷（5-azayttidine）。誘導(dǎo)分化24h，培養(yǎng)2～3周以上。觀察形成的肌樣細(xì)胞及肌管樣結(jié)構(gòu)。③神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化方案：采用多因子、分階段逐步誘導(dǎo)方法定向誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs），6進(jìn)而分化為NCs樣/星形膠質(zhì)樣

3、細(xì)胞。即：MSCs以1×10/L置入6孔培養(yǎng)板中，加入生長培養(yǎng)基：DMEM/20%FBS培養(yǎng)基，24h后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：DMEM/F12＋2％B27＋40μg/L堿性成纖維生長因子（bFGF）＋20μg/L表皮生長因子誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(EGF)，培養(yǎng)10～20d，定向誘導(dǎo)MSCs分化為NPCs。下一個(gè)階段更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為生長培養(yǎng)基：DMEM/5%FBS，分兩組進(jìn)行誘導(dǎo)：一組向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化：I華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文全反式維甲酸（RA）連續(xù)加樣，首次濃度0.5μmol/L，以后每天半量加樣；二組向星形膠質(zhì)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化：10μg/L血小板衍生生長因子B

4、B（PDGF-BB）首次加樣，以后每天半量加樣，均連續(xù)誘導(dǎo)10～14d，制作兩組細(xì)胞爬片均行纖維絲蛋白200(NF200)、膠質(zhì)纖維酸性陽性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)熒光染色。④神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞共同培養(yǎng)：收集誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，各自濃度1×610/L，以1：1混合在DMEM/5%FBS培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。觀察兩組細(xì)胞生長情況。⑤應(yīng)用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)單獨(dú)誘導(dǎo)分化的NCs樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的增殖及存活情況，繪制生長曲線及細(xì)胞存活曲線。結(jié)果①經(jīng)DMEM/10%FBS培養(yǎng)基＋0.1μmol/l地塞米松＋50ng/ml維生素C＋2.16m

5、g/mlβ-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)2周以上，MSCs細(xì)胞聚集呈結(jié)節(jié)狀，鈣鹽沉積，VanKossa銀染色法陽性。茜素紅染色陽性。②經(jīng)3μmol/l5-氮胞苷誘導(dǎo)處理大鼠MSCs，24小時(shí)部分細(xì)胞胞體收縮變?yōu)槭蓍L形狀，1~2周后細(xì)胞相互形成肌管樣結(jié)構(gòu)。2周后可以觀察到自發(fā)搏動(dòng)。③bFGF＋EGF連續(xù)誘導(dǎo)7d后MSCs分化為球團(tuán)樣的神經(jīng)前體樣細(xì)胞，巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽性。RA、PDGF-BB分別連續(xù)誘導(dǎo)10d后MSCs逐步分化出神經(jīng)元樣、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，分別表達(dá)NF200、GFAP蛋白。④神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可以共同培養(yǎng)、生長，呈現(xiàn)各自的細(xì)胞形態(tài)。⑤活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑

6、盒CCK-8檢測(cè)顯示：神經(jīng)元樣細(xì)胞早期生長較緩慢，具有一定的增殖能力，6～7d后達(dá)到高峰，此后增殖能力明顯下降，細(xì)胞存活率明顯下降，14～15d之后細(xì)胞存活率下降到7.6%以下，難以傳代培養(yǎng)。星形膠質(zhì)樣細(xì)胞初期生長慢，5d后生長加速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，7～8d后進(jìn)入平臺(tái)期,仍保持較高的細(xì)胞存活率。結(jié)論①M(fèi)SCs是具有自我增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞?？梢哉T導(dǎo)分化為骨樣細(xì)胞、骨骼肌樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞及星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。②誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可以共同培養(yǎng)、生長。③單獨(dú)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞可繼續(xù)存活13-15d后發(fā)生自然死亡，難以傳代，星形膠質(zhì)樣細(xì)胞生長較穩(wěn)定

7、，具有較強(qiáng)的存活和增殖能力，可傳代培養(yǎng)至3代以上?！娟P(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；多向分化潛能；細(xì)胞因子；誘導(dǎo)分化；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑II華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文盒。第二部分MSCs歸巢性及對(duì)失神經(jīng)肌萎縮的作用摘要目的檢測(cè)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）經(jīng)靜脈移植后在周圍神經(jīng)損傷模型內(nèi)的遷移、分布情況，評(píng)價(jià)其對(duì)軸突、靶器官的保護(hù)作用。方法制作80只大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，收集P5代MSCs行BrdU（10μmol/L）摻和標(biāo)7記48h。經(jīng)尾靜脈注射BrdU標(biāo)記的MSCs（2×10/ml）入體內(nèi)。術(shù)后8周內(nèi)評(píng)價(jià)坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）。術(shù)后神經(jīng)斷端、肌肉組織取材均行BrdU免疫組織化